BDNF基因修飾骨髓基質(zhì)細(xì)胞脊髓內(nèi)移植對(duì)損傷脊髓的影響其機(jī)制初探.pdf

1、本文通過構(gòu)建攜帶腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurotrophfactor，BDNF)的真核表達(dá)載體PcDNA3．1-BDNF，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，觀察在BMSCs中的過量表達(dá)對(duì)移植細(xì)胞體外分化的影響，同時(shí)將其移植到脊髓損傷模型大鼠脊髓組織，評(píng)估功能恢復(fù)情況并通過免疫組織化學(xué)分析大鼠損傷脊髓caspase-3的表達(dá)。探討B(tài)MSCs治療脊髓損傷新途徑。 實(shí)驗(yàn)材料與方法： 一、BMSCs的培養(yǎng)

2、： 1、采用原代培養(yǎng)進(jìn)行BMSCs的培養(yǎng)； 2、采用免疫熒光染色法對(duì)培養(yǎng)的BMSCs進(jìn)行鑒定，進(jìn)行CD44染色； 3、BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化，進(jìn)行NSE、GFAP染色； 二、真核表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 1、從挪威大鼠血清中提取DNA，構(gòu)建真核表達(dá)載體PcDNA3．1-BDNF并鑒定； 2、離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染BMSCs細(xì)胞并篩選； 3、采用Western Blott

3、ing檢測(cè)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞中BDNF蛋白的表達(dá)； 4、RT-PCR鑒定BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs中基因的表達(dá)； 三、動(dòng)物模型制作及細(xì)胞移植： 1、采用改良的ALLen’s打擊法制作脊髓損傷動(dòng)物模型。 2、隨機(jī)分為脊髓挫傷對(duì)照組(A組)；脊髓挫傷后BMSCs組(B組)；脊髓挫傷后轉(zhuǎn)BDNF的BMSCs組(C組)。分為術(shù)后1，3，7，21天4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，每個(gè)時(shí)相點(diǎn)每組6只大鼠。 3、BMSC和轉(zhuǎn)染后的BMSCs

4、移植入大鼠損傷脊髓局部； 四、結(jié)果檢測(cè) 1、用改良的Tarlov評(píng)分進(jìn)行行為學(xué)檢查； 2、免疫組織化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)caspase-33、所有數(shù)據(jù)均以x±s表示，采用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用q檢驗(yàn)(Newman_keul s法)和t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、BMSCs的生長(zhǎng)與鑒定24小時(shí)后見少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，呈圓形、發(fā)亮，大部分細(xì)胞仍浮在培養(yǎng)液中。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，貼壁細(xì)胞增多，分布不均

5、，呈集落趨勢(shì)生長(zhǎng)。一周后呈纖維狀密集生長(zhǎng)。在細(xì)胞覆蓋約80％培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代，傳至第2-3代時(shí)應(yīng)用免疫熒光方法鑒定BMSCs標(biāo)志抗原CD44，熒光鏡下見陽(yáng)性細(xì)胞呈淡綠色熒光，在同一視野下觀察明視野下細(xì)胞生長(zhǎng)，同熒光視野相比較，9596以上細(xì)胞為CD44陽(yáng)性細(xì)胞。 2、BMSCs的體外定向誘導(dǎo)分化及免疫組織化學(xué)檢測(cè)BMSCs經(jīng)正常脊髓提取液和BDNF誘導(dǎo)24小時(shí)后，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變。這些細(xì)胞胞體變小，胞質(zhì)向核周收縮，由原來(lái)的

6、梭形變成圓形。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)元樣細(xì)胞增多。取誘導(dǎo)14天的細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色，大多數(shù)細(xì)胞呈NSE、GFAP陽(yáng)性，呈棕褐色，胞體和突起均有表達(dá)。NSE陽(yáng)性細(xì)胞率為79.7％±2.6％，GFAP陽(yáng)性細(xì)胞率為66.8％±5.7％。對(duì)照組細(xì)胞NSE，GFAP的表達(dá)很少。 3、BDNF基因重組體的鑒定從大鼠基因組DNA中PCR擴(kuò)增BDNF基因，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小符合預(yù)期，陰性對(duì)照組無(wú)片斷擴(kuò)增出。用BDNF上下游引物pB

7、DNFf和pBDNFr對(duì)構(gòu)建好的PcDNA3．1-BDNF進(jìn)行PCR分析電泳，并經(jīng)過DNA序列測(cè)定證實(shí)目的基因已插入重組質(zhì)粒。 4、RT-PCR與Western Blotting顯示篩選出的G418抗性BDNF轉(zhuǎn)染BMSCs中有BDNF蛋白的明顯表達(dá)。 5、行為學(xué)檢查情況術(shù)后1d A組、B組、C組大鼠都表現(xiàn)為雙后肢癱瘓，行為學(xué)觀察無(wú)明顯差別。7d時(shí)B組、C組大鼠運(yùn)動(dòng)功能明顯好于A組(P<0.05)，21d時(shí)B組、C組大鼠

8、已能行走，A組大鼠則行走困難。 6、脊髓損傷后caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化術(shù)后1d各組脊髓caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞都明顯增加，A、B兩組增加顯著。術(shù)后3d、7d C組caspase-3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞增加較少。術(shù)后1-14d其他各組與A組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 研究結(jié)論： 1、BMSCs可在體外經(jīng)BDNF與脊髓提取物定向誘導(dǎo)為神經(jīng)元樣細(xì)胞。 2、脂質(zhì)體法介導(dǎo)的外源