漢坦病毒N蛋白的重組表達(dá)及其IgM直接捕捉ELISA的建立和應(yīng)用.pdf

1、腎綜合征出血熱(HFRS)是由漢坦病毒(Hantavims,HV)引起的一組急性病毒性傳染病,臨床上以發(fā)熱、出血及腎損害為主的一種自然疫源性疾病.全世界均有流行,我國是高發(fā)區(qū),約占世界發(fā)病總數(shù)的90﹪以上,全國30個省市自治區(qū)均有本病的流行,近十年來,年報告發(fā)病人數(shù)4～6萬人. 漢坦病毒在全世界廣泛分布,自1976年分離到該病毒以來,不斷有新的漢坦病毒被發(fā)現(xiàn),到目前已有28個漢坦病毒血清型/基因型.我國至少存在2個血清型,即HT

2、N型(姬鼠型)和SEO型(家鼠型).小型嚙齒類動物為本病毒的主要貯存宿主,不同的漢坦病毒有不同的貯存宿主,黑線姬鼠為姬鼠型病毒的主要宿主,常引起重型出血熱,病死率約為3～5﹪;褐家鼠為家鼠型病毒的主要宿主,常引起輕型出血熱,病死率約為1﹪.本病主要通過接觸帶病毒的宿主動物及其排泄物受感染. HV屬布尼亞病毒科(Bunyaviridae),是一種有包膜病毒,其基因組為單股負(fù)鏈RNA,含大(L)、中(M)、小(S)3個基因片段,分別

3、編碼多聚酶(polymerase)、包膜糖蛋白(glycoprotein)G1和G2、核蛋白(nucleocapsidprotein.NP).S基因長全約1/6～1/8Kb,3'與5'端各有一個非編碼區(qū),只有一個開放讀碼框架,編碼一個分子量在48～50kD的核蛋白. 盡管RT-PCR能檢測漢坦病毒特異性核酸,可用于HFRS的早期診斷,但由于急性期患者病毒血癥持續(xù)時間短、滴度低而難以檢出,故檢測特異性抗體的血清學(xué)檢查,仍是目前HF

4、RS的主要確診方法. 目前血清學(xué)檢測所用抗原主要是由病毒感染細(xì)胞后收獲制備而成,由于漢坦病毒具有較強(qiáng)的傳染性,培養(yǎng)病毒需要在生物安全實驗中進(jìn)行,加上病毒在細(xì)胞中繁殖滴度低,難以獲得大量的病毒抗原.研究發(fā)現(xiàn)HV病毒感染機(jī)體后,首先誘導(dǎo)產(chǎn)生較高水平的IgM抗體,隨后產(chǎn)生IgG抗體,而早期抗體主要是由NP誘導(dǎo)產(chǎn)生的.因此,許多國內(nèi)、外學(xué)者構(gòu)建了多種表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)NP,作為HFRS的血清學(xué)診斷抗原. 目前所用HFRS血清學(xué)試驗,

5、主要是基于病毒或表達(dá)核蛋白為抗原的IgM捕捉ELISA,此法有四個主要步驟,操作煩瑣、費時.因此,建立快速、簡便、安全、敏感和特異的HFRS血清學(xué)診斷新方法有重要意義. 本研究以含有生產(chǎn)腎綜合征出血熱疫苗的Z10毒株全長S基因的質(zhì)粒為模板,通過高保真PCR亞克隆S基因核蛋白編碼區(qū),通過序列測定,分析它與國內(nèi)外漢坦病毒分離株的同源性,以確定它的代表性.構(gòu)建Z10株NP原核表達(dá)系統(tǒng)pET28a-Z10N-E.coli BL21DE3

6、,表達(dá)重組核蛋白(rNP).ELISA法檢測表達(dá)情況,通過離子交換法和Ni-NTA親和層析法提純rNP,SDS-PAGE了解rNP純化情況,Western blot檢測rNP的特異性免疫反應(yīng).并以提純的重組NP為抗原,直接標(biāo)記辣根過氧化酶(HRP),建立IgM直接捕捉ELISA.通過檢測95份HFRS患者血清(臨床表現(xiàn)典型,經(jīng)傳統(tǒng)的免疫熒光法證實)及部分健康者血清,與HV為抗原的常規(guī)IgM捕捉ELISA法進(jìn)行比較,符合率為97.78﹪,