轉(zhuǎn)基因番茄中PAcA蛋白含量的測定及其免疫防齲動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：檢測轉(zhuǎn)基因番茄中目的蛋白PAcA的表達(dá)及含量，并觀察其免疫BALB/c小鼠和SD大鼠后的免疫效果，為下一步利用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)可食嵌合體防齲疫苗的研究打下基礎(chǔ)。 方法：本研究包括四個(gè)部分：第一部分：PCR法鑒定變形鏈球菌表面蛋白PAcA與霍亂毒素B亞單位融合基因轉(zhuǎn)基因番茄子代植株。第二部分：轉(zhuǎn)基因番茄中外源性目的蛋白表達(dá)的檢測。1.提取植物蛋白，并采用BCA法測定總蛋白的含量。2.Western blot確定目的蛋白的表

2、達(dá)。3.ELISA法檢測外源性目的蛋白的濃度。第三部分：表達(dá)嵌合蛋白PAcA/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄免疫BALB/c小鼠的實(shí)驗(yàn)研究。1.動(dòng)物的選擇與分組：18只6-8周齡的雄性BALB/c小鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為：①實(shí)驗(yàn)組：喂食含有PAcA/CTB嵌合蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄汁。②陰性對(duì)照組：喂食非轉(zhuǎn)基因番茄汁。③陽性對(duì)照組：喂食滅活全菌疫苗。2.免疫途徑：灌胃免疫。3.免疫時(shí)間：每周一次，共四次。4.樣品采集時(shí)間：分別于首次免疫前和免

3、疫后第1、2、3、4周采集血液、唾液樣品，稱體重。5.特異性抗體的檢測：血清中IgG和唾液中SIgA采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(間接ELISA法)檢測。6.取小鼠心、肝、脾、肺、腎做HE染色病理切片，觀察免疫前后各器官組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。第四部分：表達(dá)嵌合蛋白PAcA/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄免疫SD大鼠的實(shí)驗(yàn)研究。1.動(dòng)物的選擇與分組：18只18天齡的雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組，每組6只，分別為：①實(shí)驗(yàn)組。②陰性對(duì)照組。③陽性對(duì)照組。2.建立齲病動(dòng)

4、物模型3.免疫途徑：灌胃免疫。4.免疫時(shí)間：第29天齡開始免疫，每周一次，共免疫四次。5.樣品采集時(shí)間和特異性抗體的檢測同免疫小鼠。6.取上下頜骨標(biāo)本，進(jìn)行齲齒計(jì)分。 結(jié)果：①轉(zhuǎn)基因番茄植株總DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳后見約1.7kb擴(kuò)增條帶，與陽性對(duì)照一致。②BCA法測得總蛋白含量約3.5mg/ml，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離出分子量約6.0×104大小的蛋白條帶，Western blot雜交證實(shí)該條帶為嵌合蛋白PAcA/CTB

5、。目的蛋白表達(dá)量約4.12μg/ml，占總蛋白的0.13％。③灌胃免疫后，小鼠和大鼠血液和唾液中抗特異性抗體從免疫后1周開始升高，高峰時(shí)間為初始免疫后第4周。實(shí)驗(yàn)組小鼠和大鼠血清中特異性IgG抗體和唾液中特異SIgA抗體水平顯著高于陰性對(duì)照組(P<0.01)。④小鼠體重變化趨勢顯示于第4周實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組存在差異(P<0.05)；各組大鼠體重變化無明顯差異。⑤HE染色病理切片觀察，三組小鼠均未發(fā)現(xiàn)特異性病理改變。但部分小鼠發(fā)生充血、炎