重組免疫毒素CTLA4-ScFv-Mel的構(gòu)建、制備及活性研究.pdf

1、器官移植是治療終末期器官功能衰竭的有效手段，免疫抑制劑的應(yīng)用可以減輕移植排斥反應(yīng)，但化學(xué)類免疫抑制劑毒副作用明顯，影響了其臨床應(yīng)用。生物制劑類免疫抑制劑尤其是免疫毒素可以通過(guò)其特異性的結(jié)合作用，清除抗原特異性T細(xì)胞，且毒副作用較小，有更好的應(yīng)用前景。
　　免疫毒素是具有導(dǎo)向能力的分子（載體）和具有細(xì)胞毒性的分子（毒素）偶聯(lián)而成的具有特異性細(xì)胞殺傷能力的雜合分子，在治療惡性腫瘤、移植排斥等方面有良好的應(yīng)用前景。
　　CTLA-

2、4是一種僅表達(dá)于活化T細(xì)胞而靜止T細(xì)胞不表達(dá)的分子，因此CTLA-4的抗原結(jié)合分子是一種理想的免疫毒素導(dǎo)向分子，由之產(chǎn)生的免疫毒素只對(duì)活化的T細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞有殺傷作用，避免了對(duì)正常靜息T細(xì)胞的非特異性損傷。
　　蜂毒肽(Melittin,Mel)是蜜蜂蜂毒的主要成分，是一種重要的抗菌肽，具有抗菌、抗輻射、抗腫瘤等作用。它由26個(gè)氨基酸組成，分子量小，免疫原性低，不易產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)；具有膜活性，直接對(duì)細(xì)胞的磷脂膜起溶解作用，抑制細(xì)胞發(fā)

3、育，是一種較理想毒素片段。
　　本研究以人源化抗CTLA-4單鏈抗體為靶向片段，特異性結(jié)合在表達(dá)CTLA-4的活化T細(xì)胞表面，以蜂毒肽類似物為毒素片段，特異性殺傷活化T細(xì)胞，設(shè)計(jì)構(gòu)建出了高效低毒的免疫毒素分子，主要用于抗移植排斥反應(yīng)。
　　利用重疊延伸PCR技術(shù)，通過(guò)兩步PCR獲得了重組免疫毒素全長(zhǎng)基因，將其與表達(dá)載體pBV220連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，重組基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體形式表達(dá)。包涵體用8M脲變性，采用稀釋復(fù)

4、性，然后用SP-Sepharose-Fast-Flow陽(yáng)離子交換柱分離純化，SephacrylS-200凝膠排阻層析柱精制，制備得到目的蛋白CTLA4-ScFv-Mel。
　　在體外活性研究中，2μmol/L的CTLA4-ScFv-Mel分別作用于非活化的T淋巴細(xì)胞、陰性對(duì)照細(xì)胞ECV-304、ConA激活的T淋巴細(xì)胞、CTLA-4陽(yáng)性細(xì)胞Raji和Jurkat細(xì)胞。結(jié)果顯示，給藥24h后各組細(xì)胞存活率下降，其中前兩組細(xì)胞的存活率

5、分別為78.9％和77.3%；而后三組分別為31.2%、32.7%和30.8%。說(shuō)明CTLA4-ScFv-Mel對(duì)CTLA-4陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷率高于正常細(xì)胞，表現(xiàn)出細(xì)胞殺傷的選擇性和高效率。
　　體內(nèi)活性研究以BEL-7402肝癌移植瘤模型和S180小鼠移植瘤模型為對(duì)象，分低、中、高三個(gè)劑量給藥，比較試驗(yàn)組和陰性對(duì)照組移植瘤相對(duì)體積等藥效學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示，CTLA4-ScFv-Mel能夠發(fā)揮促進(jìn)兩個(gè)試驗(yàn)組模型中移植瘤的存活和生長(zhǎng)的作