表達(dá)重組免疫毒素EphrinA1-PE38的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向治療膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占顱腦腫瘤的30％-50％，復(fù)發(fā)率居顱內(nèi)腫瘤首位。由于膠質(zhì)瘤具有高度侵襲性，高度異質(zhì)性和高度血管化的特點(diǎn)，在過去的30年里，盡管顯微神經(jīng)外科技術(shù)、放射治療及化療水平的不斷提高，但其平均生存期仍不足12個月，且手術(shù)創(chuàng)傷及放化療又對腦組織產(chǎn)生繼發(fā)性損害。因此，膠質(zhì)瘤的治療目前仍是醫(yī)學(xué)界的一個難題，探索腦膠質(zhì)瘤新的治療方法十分必要。
　　 腫瘤的免疫毒素治療是最近十幾年發(fā)展起來的新療法。免疫毒素(Im

2、munotoxins，ITs)是將具有導(dǎo)向能力的腫瘤特異性分子與毒素蛋白偶聯(lián)而成的一種雜合分子。由于導(dǎo)向分子可以特異地識別腫瘤細(xì)胞，所以免疫毒素在體內(nèi)可以像“導(dǎo)彈”一樣定向?qū)ふ夷[瘤細(xì)胞，并將其殺死，但同時對正常組織又不會造成損傷，因此又被稱為腫瘤治療的“生物導(dǎo)彈”。用于構(gòu)建免疫毒素“彈頭”的是毒素蛋白，如綠膿桿菌外毒素(PseudomonasExotoxin，PE)、白喉毒素(Diphtheriatoxin，DT)以及蓖麻毒素(Rici

3、n)。這些毒素分子對細(xì)胞的殺傷能力非常強(qiáng)，一般認(rèn)為，只要一個毒素分子進(jìn)入細(xì)胞，就可以使該細(xì)胞死亡，而且腫瘤細(xì)胞一般不會對毒素產(chǎn)生耐藥性。由于免疫毒素療法采取的是一種殺傷性策略，避免了停藥后復(fù)發(fā)和腫瘤產(chǎn)生耐藥性的缺點(diǎn)，是極具潛力的一種抗腫瘤治療方法。目前大量的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)免疫毒素抗腫瘤治療的可靠性和優(yōu)越性。
　　 導(dǎo)向分子是免疫毒素治療的基礎(chǔ)，免疫毒素對腫瘤特異性的殺傷作用依賴于腫瘤細(xì)胞上特異性表達(dá)的標(biāo)志物。EphA2是受體酪氨

4、酸激酶家族(ReceptorTyrosineKinase，RTKs)中的一員，其特異性的配體為EphrinA1。EphA2在成人各種正常上皮細(xì)胞中幾乎不表達(dá)，而在惡性腫瘤細(xì)胞中如惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌、大腸癌、前列腺癌、非小細(xì)胞肺癌、高侵襲性黑色素瘤中則過度異常表達(dá)。最近發(fā)現(xiàn)EphA2顯示在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞和組織中呈高表達(dá)，而在正常腦組織中幾乎沒有表達(dá)，而且EphA2蛋白高表達(dá)與患者預(yù)后顯著相關(guān)，是膠質(zhì)瘤特異性的標(biāo)志物之一。
　　 免

5、疫毒素靶向治療腫瘤需要考慮的一個關(guān)鍵問題是如何確保免疫毒素選擇性地靶向殺傷腫瘤組織而且保護(hù)周圍的正常組織免受“誤傷”。傳統(tǒng)的免疫毒素雖然也能夠選擇性的靶向殺傷腫瘤細(xì)胞，但是由于其天然的局限性:(a)難以滲透到腫瘤局部并達(dá)到一定的藥物濃度;(b)在非靶點(diǎn)組織的聚集降低了耐藥濃度且縮窄了治療窗口，因此臨床應(yīng)用受到很大的限制。因此，選擇合適的載體工具使免疫毒素在腫瘤內(nèi)起作用顯得非常重要。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有取材方法

6、簡單，體外擴(kuò)增容易，外源基因表達(dá)穩(wěn)定，可自體取材避免免疫排斥反應(yīng)以及異體干細(xì)胞移植可能出現(xiàn)的倫理問題等諸多優(yōu)點(diǎn)，為我們展示了良好的研究及應(yīng)用前景。大量文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有神經(jīng)干細(xì)胞的所有特點(diǎn)，如遷移能力和腫瘤趨化作用，可以作為良好的基因治療運(yùn)載工具。根據(jù)這一特點(diǎn)，將膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性的免疫毒素基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，使其成為能夠分泌產(chǎn)生免疫毒素的細(xì)胞，可將免疫毒素基因帶到腫瘤局部持續(xù)表達(dá)并發(fā)揮作用。本研究小組前期

7、已經(jīng)成功構(gòu)建VEGF-PE38免疫毒素并在人骨髓間充質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，證實(shí)了基因治療中入骨髓間充質(zhì)細(xì)胞作為免疫毒素載體細(xì)胞的可行性。
　　 基于以上背景，我們提出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的特異性重組免疫毒素EphrinA1-PE38靶向治療膠質(zhì)瘤可能性。本項(xiàng)目首先構(gòu)建EphA2配體（EphrinA1）、綠膿桿菌外毒素PE38組成的特異性免疫毒素EphrinA1-PE38腺病毒載體，體外轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的

8、EphrinA1-PE38能夠特異性地靶向殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，再將表達(dá)該特異性免疫毒素的間充質(zhì)干細(xì)胞回輸體內(nèi)，利用間充質(zhì)干細(xì)胞的趨瘤性，實(shí)現(xiàn)在腫瘤組織局部持續(xù)表達(dá)特異性免疫毒素EphrinA1-PE38，從而對膠質(zhì)瘤細(xì)胞產(chǎn)生特異性殺傷效應(yīng)，為膠質(zhì)瘤靶向治療探討新的治療策略。本研究主要包括四部分。
　　 第一章:重組腺病毒載體pAd-EphrinA1-PE38的構(gòu)建及包裝
　　 目的:構(gòu)建攜帶免疫毒素EphrinA1-PE38

9、的重組腺病毒載體，并進(jìn)行包裝、鑒定、純化及滴度測定，為靶向毒素治療膠質(zhì)瘤研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 方法:通過PCR獲得EphrinA1胞外端基因片段和綠膿桿菌外毒素衍生物PE38基因，酶切并測序鑒定;再通過適當(dāng)?shù)拿盖屑斑B接反應(yīng)，構(gòu)建出穿梭質(zhì)粒pAdTrack-EphrinA1-PE38，氯化鈣法制備含有骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細(xì)胞，重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶及DNA測序驗(yàn)證。用限制性內(nèi)切酶PmeⅠ線性化

10、處理后與上述感受態(tài)細(xì)胞在細(xì)菌中進(jìn)行同源性重組，構(gòu)建重組腺病毒載pAd-EphrinA1-PE38。PacⅠ線性化處理后在人胚腎細(xì)胞(HEK293)中進(jìn)行包裝，PCR法對重組子進(jìn)行鑒定、倍比稀釋法檢測病毒滴度。
　　 結(jié)果:經(jīng)酶切及測序驗(yàn)證，成功PCR獲得本實(shí)驗(yàn)需要的EphrinA1胞外端基因片段及PE38基因片段;酶切分析及DNA序列測定證實(shí)，EphrinA1-PE38融合基因被成功克隆入腺病毒表達(dá)質(zhì)粒載體，經(jīng)過細(xì)菌內(nèi)同源性重組

11、，成功構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-EphrinA1-PE38;并在KEK293細(xì)胞中完成包裝;倍比稀釋法檢測病毒滴度達(dá)到109pfu/mL數(shù)量級。
　　 結(jié)論:本研究成功在細(xì)菌內(nèi)同源性重組構(gòu)建重組腺病毒載體pAd-EphrinA1-PE38，并利用HEK293細(xì)胞包裝成腺病毒，為后續(xù)靶向細(xì)胞毒性及抗腫瘤作用奠定基礎(chǔ)。
　　 第二章:分泌EphrinA1-PE38的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的建立
　　 目的:建立人骨髓間充質(zhì)

12、干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)方法;觀察重組腺病毒Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs的效率、對hMSCs細(xì)胞增殖的影響以及目的基因的表達(dá)。
　　 方法:應(yīng)用密度梯度離心法分離人hMSCs，條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察hMSCs形態(tài)學(xué)變化;流式細(xì)胞儀檢測hMSCs的表面標(biāo)記以及細(xì)胞周期。以不同感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)的腺病毒的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs，熒光顯

13、微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率、CCK-8法檢測hMSCs的增殖、RT-PCR法及ELISA法分別從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測感染Ad-EphrinA1-PE38后目的基因在hMSCs中的表達(dá)分泌。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±SE)表示，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用析因方差分析不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染對hMSCs增殖的影響，用單因素方差分析對不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染后hMSCs分泌的E

14、phrinA1-PE38進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果:用密度梯度離心法成功地分離培養(yǎng)出了hMSCs。典型的hMSCs貼壁生長，以長梭形為主，體積小，核漿比大，呈明顯的同向性排列。流式檢測結(jié)果顯示:hMSCs高表達(dá)粘附分子CD29(97.77％)，CD44(92.73％)及CD105(90.94％);低表達(dá)造血系細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34(1.4％)，CD45(0.07％)和人類白細(xì)胞抗原HLA-DR(0.

15、14％)。hMSCs的S+G2+M期的細(xì)胞為18.3％，大部分細(xì)胞仍是處于靜止?fàn)顟B(tài)，說明hMSCs具有較強(qiáng)的增殖能力。Ad-EphrinA1-PE38感染后24h即可見綠色熒光(GFP)，此后熒光逐漸增多，7d熒光表達(dá)最強(qiáng)。7d時感染復(fù)數(shù)(MOI)分別為100、400、800、1200的病毒感染率分別為:24％、43％、88％、90％。不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染對hMSCs增殖的影響有顯著性差異(F=36.839，

16、P=0.000)。進(jìn)一步用單因素方差分析(one-wayANOVA)對每一個時間點(diǎn)各MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染對hMSCs增殖進(jìn)行多重比較。除d1、d2外，d3、d4、d5、d6、d7各組hMSCs的增殖具有顯著性差異，F(xiàn)值分別為:3.593、6.464、7.180、10.277、14.385，P值均＜0.05;1200MOI組hMSCs增殖顯著低于其余各組，未感染組(UT)組與100、400、800MOI組與無顯著性

17、差異（P＞0.05）。說明感染復(fù)數(shù)(MOI)在800以下時，對細(xì)胞活力無顯著影響，當(dāng)病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)達(dá)到1200時，對細(xì)胞增殖產(chǎn)生抑制。RT-PCR可以檢測到約700bp的目的基因的表達(dá)條帶。ELISA結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn):不同MOI的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs分泌EphrinA1-PE38的量具有顯著性差異(F=59.773，P=0.000)，800MOI組與100MOI、400MOI組之間有顯著性差異(P＜

18、0.05);而800MOI、1200MOI組之間無顯著性差異(P＞0.05)。取MOI=800的Ad-EphrinA1-PE38感染hMSCs細(xì)胞，3天后即可檢測到EphrinA1-PE38的分泌，第6天達(dá)到高峰并持續(xù)約12天，此后EphrinA1-PE38的分泌開始下降，33d仍有分泌。
　　 結(jié)論:本研究通過密度梯度離心法成功分離出具有較高純度的hMSCs，細(xì)胞免疫表型與典型MSCs相似。合適感染復(fù)數(shù)的重組腺病毒Ad-Eph

19、rinA1-PE38可以有效感染hMSCs，對hMSCs的細(xì)胞增殖無明顯影響。感染Ad-EphrinA1-PE38的hMSCs能夠在一定時間內(nèi)持續(xù)分泌一定量的EphrinA1-PE38。
　　 第三章:骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EphrinA1-PE38對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用
　　 目的:觀察hMSCs分泌的重組免疫毒素EphrinA1-PE38對EphA2陽性的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒作用，同時探討其可能的作用機(jī)制

20、。
　　 方法:首先利用WesternBlot檢測EphA2受體在不同人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株(U251、A172、SHG44、U87)上的表達(dá)。為檢測EphrinA1-PE38對EphA2陽性的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的特異性殺傷效應(yīng)，將U251細(xì)胞及EphA2陰性對照細(xì)胞T47D及EphA2表達(dá)抑制的U251[EphrinA1](+)細(xì)胞按1×104/每孔均勻鋪于96孔板，加入不同劑量(12.5μl、25μl、50μl、100μl)的感染Ad-Ep

21、hrinA1-PE38的hMSCs細(xì)胞培養(yǎng)上清，繼續(xù)培養(yǎng)72小時，CCK-8法檢測EphrinA1-PE38對靶細(xì)胞的增殖影響;為進(jìn)一步檢測EphrinA1-PE38細(xì)胞毒作用的靶向性，EphrinA1-PE38上清加入U251細(xì)胞前以EphrinA1抗體預(yù)孵育1h，觀察其能否拮抗EphrinA1-PE38對U251細(xì)胞的殺傷作用。TUNEL法和AnnexinV-PI法檢測EphrinA1-PE38誘導(dǎo)U251細(xì)胞的凋亡作用。所有數(shù)據(jù)采

22、用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±SE)表示，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用析因方差分析EphrinA1-PE38對EphA2陽性及EphA2陰性的瘤細(xì)胞的選擇性殺傷效應(yīng)。EphrinA1-PE38感染上清和未感染hMSCs上清誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡的組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)意義。
　　 結(jié)果:WesternBolt檢測發(fā)現(xiàn)EphA2受體在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251、A172、SHG44中高表達(dá)，在U8

23、7中表達(dá)較低，但仍高于正常水平;而在陰性對照腫瘤細(xì)胞T47D以及正常細(xì)胞hMSCs中，未檢測出EphA2受體的表達(dá);轉(zhuǎn)染EphrinA1基因的U251[EphrinA1](+)細(xì)胞幾乎沒有EphA2受體的表達(dá)。CCK-8法檢測EphrinA1-PE38上清對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷效應(yīng)，析因方差分析顯示:不同濃度細(xì)胞感染上清對U251的增殖抑制效應(yīng)之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=175.828，P=0.000);感染上清對EphA2陰性的T47

24、D細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.855，P=0.078);對EphA2表達(dá)抑制的U251[EphrinA1](+)細(xì)胞同樣沒有顯著的殺傷效應(yīng)，不同濃度細(xì)胞感染上清對U251[EphrinA1](+)細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=2.255，P=0.070)。抗體中和實(shí)驗(yàn)表明，EphrinA1抗體能夠拮抗EphrinA1-PE38對U251細(xì)胞的殺傷作用(F=84.596，P=0.000)。TUNEL檢測結(jié)果表明E

25、phrinA1-PE38上清顯著促進(jìn)U251凋亡，EphrinA1-PE38感染上清處理組U251細(xì)胞凋亡率為（39.44±8.86）％，與對照組未感染hMSCs上清組的凋亡率（4.39±1.42）％相比，凋亡率顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.731，P=0.000)。AnnexinV-PI流式檢測結(jié)果與TUNEL結(jié)果基本一致，感染上清處理組顯著高于未感染組。
　　 結(jié)論:hMSCs分泌的重組免疫毒素EphrinA1-P

26、E38對EphA2陽性的膠質(zhì)瘤具有特異性殺傷效應(yīng)，EphrinA1-PE38對膠質(zhì)瘤細(xì)胞特異性殺傷過程中，誘導(dǎo)靶細(xì)胞發(fā)生凋亡。
　　 第四章:分泌EphrinA1-PE38的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)移植對膠質(zhì)瘤生長的抑制作用
　　 目的:觀察hMSCs分泌的重組免疫毒素EphrinA1-PE38對U251移植瘤生長的影響并對其作用機(jī)制做初步研究，探討hMSCs作為靶向毒素基因治療負(fù)載體系的可行性。
　　 方法:體外培

27、養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，建立裸鼠皮下移植瘤模型。一周后實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為三組:PBS組、單純hMSCs移植組、hMSCs-EphrinA1-PE38移植組;荷瘤裸鼠接受瘤內(nèi)細(xì)胞移植，三組分別組瘤內(nèi)注射10μlPBS，1×106hMSCs(10μl)、1×106感染Ad-EphrinA1-PE38的hMSCs(10μl)。每隔3～4天測量皮下移植瘤體的大小一次，繪制腫瘤生長曲線。采用ELISA法檢測腫瘤組織中EphrinA1-PE38的的分

28、泌變化。腫瘤組織冰凍切片處理后，熒光顯微鏡下觀察hMSCs--EphrinA1-PE38在腫瘤組織內(nèi)的存在情況。為檢測腫瘤組織凋亡，免疫熒光法檢測各組裸鼠腫瘤中Caspase-3和Ki-67的表達(dá)。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((x)±SE)表示，并用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積變化采用重復(fù)測量方差分析，不同時間點(diǎn)的組間比較前首先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊性，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間的多

29、重比較采用LSD分析，若方差不齊，采用Welch校正的方差分析，組間的多重比較采用Dunnett'sT3分析。
　　 結(jié)果:各組給予不同治療后，在不同時間點(diǎn)對移植性人腦膠質(zhì)瘤模型腫瘤體積觀測，經(jīng)重復(fù)測量方差分析，表明各組移植性人腦膠質(zhì)瘤腫瘤體積顯示出顯著的分組效應(yīng)(F=93.296，P＜0.001)和時間效應(yīng)(F=212.394，P＜0.001)以及分組與時間的交互效應(yīng)(F=24.308，P＜0.001)，說明不同治療方法和時間

30、因素對各組荷瘤裸鼠移植瘤體積有影響，組間差異大小在不同時間點(diǎn)不一樣。進(jìn)一步用單因素方差分析對每一個時間點(diǎn)各組動物的移植瘤體積進(jìn)行多重比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)從接種腫瘤后第12天開始三組荷瘤裸鼠腫瘤體積具有顯著差異，hMSCs-EphrinA1-PE38細(xì)胞移植組腫瘤體積明顯比單純hMSCs移植組和PBS對照組小，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且隨著時間延長越來越顯著，表明hMSCs-EphrinA1-PE38細(xì)胞移植對裸鼠U251膠質(zhì)瘤生長

31、具有明顯的抑制作用。單純hMSCs移植組和PBS對照組之間相比較，單純hMSCs移植組荷瘤裸鼠腫瘤體積雖然較PBS對照組生長緩慢，但二者之間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。ELISA發(fā)現(xiàn)移植后第2天即可在腫瘤組織內(nèi)檢測到感染后hMSCs分泌的EphrinA1-PE38，第5天達(dá)到高峰，隨即下降。腫瘤組織冰凍切片在熒光顯微鏡下可見散在分布的綠色熒光蛋白GFP標(biāo)記hMSCs-EphrinA1-PE38細(xì)胞，單純hMSCs組及PBS對照組腫瘤

32、組織標(biāo)本內(nèi)未見到綠色熒光蛋白的表達(dá)。用cleavedcaspase-3和ki-67抗體對腫瘤組織進(jìn)行免疫熒光染色。計(jì)數(shù)被標(biāo)記的陽性細(xì)胞率，經(jīng)單因素方差分析，不同處理組腫瘤組織凋亡情況具有顯著性差異，hMSCs-EphrinA1-PE38細(xì)胞移植組腫瘤組織cleavedcaspase-3陽性細(xì)胞顯著增多(F=7.797，P=0.015)，ki-67陽性細(xì)胞顯著減少(F=6.913，P=0.010)，較單純hMSCs組及PBS對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)