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文檔簡介
1、目的:
廣泛認(rèn)為,異常的細(xì)胞代謝是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)重要標(biāo)志,并且許多腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出強(qiáng)烈的谷氨酰胺代謝依賴性。谷氨酰胺強(qiáng)烈依賴型的細(xì)胞表現(xiàn)出對大量的谷氨酰胺的攝取,它不僅為細(xì)胞核苷酸和氨基酸合成提供氮源,它還在其它氨基酸的攝取和mTOR通路的持續(xù)激活中起著重要的作用。此外,在許多腫瘤細(xì)胞中,谷氨酰胺是最重要的線粒體底物以維持線粒體膜的完整與穩(wěn)定,同時(shí),它還為合成NADPH提供源料以維持細(xì)胞的氧化還原平衡。因此,谷氨酰胺代謝在腫瘤細(xì)
2、胞中的這些重要性也使它成為腫瘤診斷、監(jiān)測與治療的一個(gè)非常好的靶向窗口。
腫瘤細(xì)胞是通過上調(diào)一個(gè)或多個(gè)谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)來滿足其增加的谷氨酰胺需求,如果能夠?qū)⑦@些上調(diào)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體鑒定出來,那么它們將成為抗腫瘤新藥研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。ASCT2是目前報(bào)道最為詳盡且在許多腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)體,然而,對于它的調(diào)控機(jī)制研究以及其臨床重要性報(bào)道較少。我們的研究目的是闡明ASCT2在結(jié)直腸癌中的臨床重要性、調(diào)控機(jī)制以及ASCT
3、2在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。
方法:
我們利用含有90對結(jié)腸癌患者的組織芯片進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)及分析,代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)用于分析ASCT2在谷氨酰胺代謝中的重要性。熒光素報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于鑒定miR-137對于ASCT2的直接作用。染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)用于確定miR-137沉默的調(diào)控機(jī)制。慢病毒感染的結(jié)直腸癌細(xì)胞用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及小鼠移植癌實(shí)驗(yàn)。所有的實(shí)驗(yàn)來自于三次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果分析。
結(jié)果:
4、為了確定ASCT2在結(jié)直腸癌中的臨床重要性,我們檢測了90對結(jié)直腸癌病人的腫瘤切片,發(fā)現(xiàn)ASCT2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)量明顯高于所對應(yīng)的正常結(jié)腸組織中的表達(dá)量。這一結(jié)果與其在其它腫瘤中如肺腺癌、前列腺癌、乳腺癌中結(jié)果一致。ASCT2的表達(dá)量并沒有隨結(jié)直腸癌的TNM分期呈現(xiàn)遞增的趨勢,且其表達(dá)量與結(jié)直腸癌患者的預(yù)后相關(guān)性并不明顯,這些結(jié)果說明ASCT2在腫瘤的起始階段較為重要。
基于以上結(jié)果,我們進(jìn)一步評估了ASCT2在結(jié)直腸癌細(xì)
5、胞生長中重要性以及確定了它的一個(gè)新的調(diào)控機(jī)制。利用兩個(gè)特異性的shRNA將多株結(jié)直腸癌細(xì)胞中的ASCT2沉默后發(fā)現(xiàn),與對照細(xì)胞相比,ASCT2沉默后的細(xì)胞株生長明顯減慢。通過PI染色發(fā)現(xiàn),ASCT2沉默主要導(dǎo)致細(xì)胞周期中G1期的阻滯,與對照細(xì)胞相比,停留在DNA合成前期G1期的細(xì)胞數(shù)量增加,相應(yīng)的處于DNA合成期的S期以及DNA合成后期的G2期減少,說明ASCT2沉默對細(xì)胞生長的抑制作用是通過細(xì)胞周期阻滯來完成的。機(jī)制方面,我們確定了A
6、SCT2是miR-137的一個(gè)直接靶點(diǎn)。瞬時(shí)的miR-137過表達(dá)可以導(dǎo)致ASCT2蛋白質(zhì)以及mRNA水平下調(diào),而當(dāng)細(xì)胞導(dǎo)入miR-137的抑制劑時(shí),ASCT2的蛋白以及mRNA水平則會上調(diào),這都說明了miR-137與ASCT2之間存在著聯(lián)系。并且,在不同腫瘤細(xì)胞中分別過表達(dá)miR-137,均能檢測到ASCT2水平的下降,說明這一調(diào)控機(jī)制的存在是廣譜的。接著,我們通過熒光素基因報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了miR-137通過靶向ASCT2的3‘UTR區(qū)
7、域來行使其調(diào)控功能。miR-137的過表達(dá)能減弱帶有野生型ASCT23’UTR的熒光素表達(dá)值,而對于突變型ASCT23‘UTR的熒光素表達(dá)值幾乎無明顯影響,說明miR-137通過與ASCT23’UTR區(qū)域結(jié)合來負(fù)調(diào)控ASCT2,這一結(jié)果與大多數(shù)microRNA調(diào)控下游靶基因的原理一致。
為了闡明ASCT2在谷氨酰胺代謝中的重要性,我們利用代謝組學(xué)實(shí)驗(yàn)分析了ASCT2沉默之后代謝產(chǎn)物與對照代謝產(chǎn)物表達(dá)量的差異。我們發(fā)現(xiàn),ASCT
8、2的沉默廣泛減少了三羧酸循環(huán)產(chǎn)物生成、非必需氨基酸、脂類以及核苷酸的合成,而導(dǎo)致葡萄糖以及果糖等在細(xì)胞中大量堆積。這些結(jié)果都反映了,ASCT2的沉默會導(dǎo)致細(xì)胞代謝的癱瘓。同時(shí),我們也檢測了miR-137過表達(dá)之后細(xì)胞的代謝水平,發(fā)現(xiàn)miR-137過表達(dá)對細(xì)胞谷氨酰胺代謝的影響與ASCT2沉默后的結(jié)果一致,說明miR-137是通過調(diào)控ASCT2來對谷氨酰胺代謝產(chǎn)生影響的。
由于結(jié)直腸癌的一個(gè)重要特征是廣泛的miRNA下調(diào),其中就
9、包括miR-137,這激起了我們對于其下調(diào)機(jī)制研究的興趣。染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)反映了MeCP2和DNMT3B選擇性地結(jié)合于之前所報(bào)道的miR-137甲基化的啟動(dòng)子區(qū)域。接著,我們分別用DNMT3B的抑制劑Decitabine和MeCP2的shRNA去處理HCT116細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)胞中miR-137的水平升高了,相應(yīng)地ASCT2的蛋白水平下降了。同時(shí),我們對于這兩種處理后的細(xì)胞進(jìn)行了染色體免疫共沉淀實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)與未處理的對照細(xì)胞相比,
10、無論是用Decitabine處理的細(xì)胞還是導(dǎo)入shMeCP2的細(xì)胞,DNMT3B與MeCP2在miR-137對應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合率都下降了。這都充分說明了DNMT3B和MeCP2介導(dǎo)了miR-137的甲基化沉默。MiR-137沉默機(jī)制的發(fā)現(xiàn)從側(cè)面證明了ASCT2在結(jié)直腸癌中過表達(dá)的原因。
最后,我們在12對結(jié)直腸癌腫瘤組織及癌旁正常組織中確認(rèn)了miR-137與ASCT2之間的負(fù)相關(guān)性,這一結(jié)果與細(xì)胞中兩者的負(fù)相關(guān)性一致。此外
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