2型囊泡谷氨酸轉運體與神經病理性疼痛的相關性研究.pdf

1、研究背景：
　　谷氨酸在疼痛信號的傳遞和調控過程中發(fā)揮關鍵作用。已有大量研究證實，神經病理性疼痛與谷氨酸過度釋放有關。囊泡谷氨酸轉運體(vesicular glutamatetransporters，VGLUTs)，負責將胞內的谷氨酸攝取入囊泡，完成谷氨酸的儲存、隔離和釋放，因此對突觸間隙的谷氨酸動態(tài)平衡具有重要影響。在VGLUTs的3個亞型中，2型囊泡谷氨酸轉運體(vesicular glutamate transporter2

2、，VGLUT2)主要表達于脊髓、丘腦和低位腦干，在一些杏仁核和皮層結構中也有表達，提示VGLUT2可能參與了疼痛信號的傳遞和加工。近期的研究發(fā)現(xiàn)VGLUT2表達降低的小鼠神經病理性疼痛表現(xiàn)消失或減弱，同時VGLUT2表達降低導致丘腦神經元興奮性突觸后電流幅度和頻率下降，進一步表明VGLUT2與神經病理性疼痛相關。盡管如此，神經病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中VGLUT2的表達是否發(fā)生改變，VGLUT2的表達變化如何影響谷氨酸能神經傳遞，抑制VG

3、LUT2的功能能否對抗疼痛等等還鮮有報道。本研究室前期研究發(fā)現(xiàn)，神經病理痛大鼠的背根神經節(jié)、脊髓中VGLUT2的表達上調，本研究重點關注神經病理痛進程中小鼠腦內VGLUT2的表達和功能變化，以及VGLUT抑制劑對谷氨酸釋放和疼痛行為的影響。
　　研究目的：
　　研究神經病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中小鼠腦內VGLUT2表達與功能的改變及其影響疼痛信息傳遞的機制，觀察VGLUT抑制劑功能對動物疼痛反應和谷氨酸釋放的影響。
　　

4、研究方法：
　　第一部分是建立神經病理性疼痛模型，觀察不同時間點疼痛相關腦區(qū)VGLUT2表達的改變，探討VGLUT2表達改變對谷氨酸囊泡攝取和釋放的影響。包括:1）建立坐骨神經選擇性損傷(spared nerve injury，SNI)模型:結扎并剪斷C57小鼠坐骨神經三個分支中的腓總神經和脛神經，保持腓腸神經不受損傷。術后以VonFrey法測試動物腓腸神經支配域機械痛閾的變化。2）VGLUT2表達檢測:于SNI造模后不同時間（0

5、.5，1，1.5，3，7，14，28天）取小鼠全腦，采用免疫組織化學法檢測丘腦、水管周圍灰質(Periaqueductal gray，PAG)、雙側杏仁核和雙側內側前額葉皮層(medial prefrontal cortex，mPFC)中VGLUT2表達的改變。3）VGLUT2功能檢測:在囊泡谷氨酸攝取實驗中，分別于SNI造模后1天和14天，分離丘腦突觸囊泡并與系列濃度的谷氨酸共同孵育，應用微透析和HPLC-ECD測定孵育液中谷氨酸濃度

6、的變化，以此反映谷氨酸的囊泡攝取;在突觸體谷氨酸釋放實驗中，分別于SNI造模后1天和14天，制備丘腦突觸體，與谷氨酸脫氫酶及NADP+共孵育，通過熒光酶標儀檢測反應產物NADPH的熒光強度，以確定孵育液中谷氨酸濃度。
　　第二部分是選擇系列VGLUT功能抑制劑作為工具藥，研究抑制劑對神經痛小鼠機械痛閾和丘腦谷氨酸釋放的影響，以及對疼痛相關腦區(qū)神經元c-Fos表達的影響;觀察抑制劑對動物運動協(xié)調能力與其他疼痛行為的影響。包括1）抑制

7、VGLUT功能對疼痛的影響:在SNI和奧沙利鉑誘發(fā)神經痛的形成期或維持期，腦室給藥VGLUT抑制劑，觀察動物機械痛閾的變化。2）對運動協(xié)調性和其他疼痛的作用:采用轉棒實驗研究VGLUT抑制劑腦室給藥對動物運動協(xié)調性的影響，并在小鼠熱板模型、福爾馬林模型及醋酸扭體模型上對抑制劑進行作用研究。3)對c-Fos表達的影響:免疫組化法檢測抑制劑對SNI術后早期腦內c-Fos表達的影響。4）突觸體谷氨酸釋放的測定:SNI造模后1天提取動物的丘腦突

8、觸體，與VGLUT抑制劑共孵育，熒光酶標儀檢測抑制劑對動物去極化引發(fā)的谷氨酸釋放的影響。
　　研究結果：
　　1)SNI術后VGLUT2表達和功能的改變
　　SNI造模后1天，丘腦、PAG和雙側杏仁核中VGLUT2表達均顯著升高，從造模后1.5天開始到28天VGLUT2表達逐漸下降到假手術水平;SNI術后1天，小鼠丘腦突觸體囊泡的谷氨酸攝取速率，在外加谷氨酸濃度為1000μM和2000μM時顯著升高，而SNI術后14天

9、的谷氨酸攝取速率沒有明顯變化;SNI術后1天，小鼠丘腦突觸體去極化引發(fā)的谷氨酸釋放明顯升高，在術后14天，谷氨酸的釋放與假手術組相比沒有明顯差別。
　　2)VGLUT抑制劑對神經痛疼痛反應的影響
　　SNI損傷后立即腦室注射VGLUT抑制劑CSB6B（5μg/只）、Rose Bengal(5μg/只)、Xanthurenic Acid（10μg/只）、Brilliant Yellow（5μg/只）之后每12小時注射一次，與溶

10、劑組(aCSF，5μl/只)相比，能顯著抑制SNI術后0.5天和1天的動物機械痛閾下降，而在SNI術后的疼痛維持期，CSB6B和Rose Bengal(5μg，i.c.v.)沒有明顯的鎮(zhèn)痛作用;在奧沙利鉑致神經痛模型上，造模同時每12小時CSB6B（5μg，i.c.v.）伴隨給藥，與模型組相比，能夠明顯抑制奧沙利鉑第一次給藥后1.5到4天的動物機械痛閾下降。CSB6B（1 mg·kg-1，i.p.）預防或治療性給藥對SNI誘發(fā)的機械痛敏

11、均無顯著的鎮(zhèn)痛作用。
　　3)VGLUT抑制劑對對運動協(xié)調性和其他疼痛的影響
　　動物運動協(xié)調功能的研究表明，CSB6B（5μg，i.c.v.）對小鼠的轉棒掉落潛伏期沒有明顯影響。CSB6B(2.5 mg·kg-1，i.p.)對小鼠50和55℃的熱板反應沒有明顯的影響;CSB6B（2.5 mg·kg-1，i.p.）作用30 min和60 min能夠明顯抑制醋酸引發(fā)的小鼠扭體反應;CSB6B（0.5 mg·kg-1，i.p.）

12、作用30 min后能夠明顯降低小鼠福爾馬林模型的二相舔足時間，而對福爾馬林一相疼痛沒有明顯影響。
　　4)VGLUT抑制劑對神經痛c-Fos表達和谷氨酸釋放的影響
　　c-Fos表達的檢測結果表明，丘腦、PAG在SNI術后1天，PAG和對側mPFC在SNI術后1.5天時，與假手術組相比，模型組神經元c-Fos的表達明顯上升;與模型組相比，CSB6B(5μg，i.c.v.)能夠明顯降低丘腦在SNI術后0.5天與對側mPFC在術

13、后1.5天的c-Fos表達。進一步實驗表明，CSB6B與SNI術后丘腦突觸體共孵育30 min后能夠明顯抑制突觸的谷氨酸釋放，IC50為25.7μM。
　　結論：
　　神經病理性疼痛早期腦內VGLUT2表達升高，同時丘腦神經元囊泡谷氨酸攝取和突觸體谷氨酸釋放能力均顯著增強，提示VGLUT2在神經痛早期發(fā)揮了作用。VGLUT功能抑制劑不影響動物運動協(xié)調能力，卻可緩解動物神經痛早期的機械痛敏，抑制神經痛誘導的c-Fos表達。VG