FG020326及酪氨酸激酶抑制劑lapatinib和sunitinib逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥抗藥性作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的：腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生原發(fā)和繼發(fā)耐藥是腫瘤有效治療的主要障礙。多種機(jī)制參與腫瘤細(xì)胞耐藥性的形成，包括藥物作用靶點(diǎn)的改變，DNA損傷后修復(fù)能力增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞凋亡逃避，細(xì)胞周期檢測點(diǎn)改變，化療藥物代謝酶誘導(dǎo)性活性增強(qiáng)或表達(dá)升高以及腫瘤細(xì)胞對化療藥物的攝取減少主動(dòng)外排增加等。其中ATP結(jié)合盒膜通道轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP—bindingcassette(ABC)transporters)能量依賴性將結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的抗腫瘤藥物外排到

2、腫瘤細(xì)胞外是產(chǎn)生多藥耐藥性(multidrugresistance，MDR)的主要原因。在人類基因中，目前發(fā)現(xiàn)它共有48個(gè)成員，依據(jù)它們序列的相似性被分為7大類，從ABCA至ABCG。在這個(gè)家族中，與腫瘤MDR關(guān)系最為密切的是P—糖蛋白(P—glycoprotein，P—gp/MDR1/ABCB1)、多藥耐藥性相關(guān)蛋白(multidrugresistanceassociated—proteins，MRPs/ABCCs)和乳腺癌耐藥蛋白(

3、breastcancerresistanceproteinBCRP/ABCG2/MXR)。ABCB1由12個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和2個(gè)ATP結(jié)合盒組成，ABCC1和ABCB1結(jié)構(gòu)相似，但在N—末端還包含5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，而ABCG2則只包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1個(gè)位于N—末端的ATP結(jié)合盒，屬于半轉(zhuǎn)運(yùn)體。這些ABCtransporters在腫瘤細(xì)胞膜過度表達(dá)時(shí)會(huì)結(jié)合抗癌藥物，同時(shí)其ATP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合ATP，ATP水解釋放能量促使藥物被泵到胞外，使細(xì)胞內(nèi)

4、藥物濃度始終維持在較低水平，腫瘤細(xì)胞從而獲得耐藥性。目前研究最為深入的是ABCB1介導(dǎo)的MDR。 理論上克服MDR有多種方法：如開發(fā)對腫瘤MDR細(xì)胞不具抗藥性的新型抗癌藥物；尋找高效、低毒對抗癌藥物藥代動(dòng)力學(xué)無影響的MDR逆轉(zhuǎn)劑與抗癌藥物合用，恢復(fù)MDR腫瘤細(xì)胞對抗癌藥物敏感性；降低耐藥蛋白表達(dá)等。 第一代逆轉(zhuǎn)劑如環(huán)孢素A和維拉帕米由于自身毒副作用限制了其進(jìn)一步的研究，第二代逆轉(zhuǎn)劑如valspodar(PSC833)和b

5、iricodar(VX-710)盡管毒性減少，但由于會(huì)干擾聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤藥物的藥代動(dòng)力學(xué)產(chǎn)生不可預(yù)測的毒副作用而限制了進(jìn)一步的應(yīng)用。盡管到目前為止真正能夠用于臨床的逆轉(zhuǎn)劑尚未開發(fā)成功，但根據(jù)定量結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系(quantitativestructure-activityrelationships，QSARs)和組合化學(xué)方法所開發(fā)的具有高特異性逆轉(zhuǎn)作用的第三代逆轉(zhuǎn)劑如LY335979，ONT-093，R101933，GF120918以及X

6、R9576等在與抗癌藥物合用時(shí)很少干擾后者的藥代動(dòng)力學(xué)，這也讓研究者們看到了最終克服MDR的曙光。 酪氨酸激酶抑制劑(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)通過與ATP競爭性結(jié)合到酪氨酸激酶催化區(qū)域ATP結(jié)合位點(diǎn)從而阻斷酪氨酸激酶磷酸化后下游信號的激活，進(jìn)而使細(xì)胞周期阻滯，抑制腫瘤血管生成，阻斷腫瘤細(xì)胞的浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；體外生物化學(xué)及細(xì)胞評價(jià)方法發(fā)現(xiàn)TKIs可以調(diào)節(jié)ABCtransport

7、ers的功能。 本研究對多芳基取代咪唑類化合物FG020326的逆轉(zhuǎn)機(jī)制，酪氨酸激酶抑制劑lapatinib和sunitinib與ABCtransporters的關(guān)系進(jìn)行了研究。 研究方法：細(xì)胞毒測定用MTT法；以KBv200細(xì)胞建立裸鼠移植瘤模型探討FG020326和lapatinib體內(nèi)逆轉(zhuǎn)活性；蛋白測定用Westernblotting；ABCB1和ABCG2在mRNA表達(dá)水平用RT-PCR法測定；RNA干擾法觀察沉

8、默Erk后對KBv200細(xì)胞存活的影響；阿霉素，羅丹明123積累以流式細(xì)胞儀測定；高壓氮?dú)馄屏逊ㄖ苽浼?xì)胞膜泡并用快速濾膜過濾法進(jìn)行膜泡藥物輸送實(shí)驗(yàn)測定lapatinib和sunitinib對ABCB1和ABCG2介導(dǎo)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的影響；釩敏感法測定FG020326對ABCB1ATPase活性，lapatinib對ABCB1和ABCG2ATPase活性的影響；[125I]-Iodoarylazidoprazosin(IAAP)和[3H]azi

9、dopine光親和標(biāo)記實(shí)驗(yàn)探討lapatinib與ABCB1和ABCG2的作用位點(diǎn)以及FG020326與ABCB1作用位點(diǎn)情況；藥代動(dòng)力學(xué)測定用HPLC法；超速離心法制備人肝微粒體并用HPLC法測定FG020326或lapatinib對CYP3A4活性的影響。 結(jié)果: 1.以ABCB1高表達(dá)細(xì)胞MCF—7/Adr和KBv200及相應(yīng)親本敏感細(xì)胞株MCF—7和KB，ABCC1高表達(dá)細(xì)胞KB—CV60及親本敏感細(xì)胞KB—3-

10、1，ABCC4高表達(dá)細(xì)胞NIH3T3/MRP4-2及親本敏感細(xì)胞NIH3T3，ABCG2高表達(dá)細(xì)胞S1-M1-80及敏感細(xì)胞S1，LRP高表達(dá)細(xì)胞SW1573/2R120和敏感細(xì)胞SW1573為模型，體外評價(jià)FG020326逆轉(zhuǎn)活性。FG020326濃度依賴性地增加ABCB1底物紫杉醇，阿霉素和長春新堿對MDR細(xì)胞MCF—7/Adr和KBv200的細(xì)胞毒作用，而對非ABCB1底物順鉑和5-FU的細(xì)胞毒作用則無明顯影響；FG020326濃

11、度依賴性地增加阿霉素和羅丹明123在MDR細(xì)胞中積累，但不影響阿霉素和羅丹明123在相應(yīng)敏感細(xì)胞中積累，同時(shí)顯著抑制ABCB1對阿霉素的外排，說明FG020326通過抑制ABCB1藥物外排泵功能恢復(fù)MDR細(xì)胞對化療藥物的敏感性。 FG020326濃度依賴性地抑制[3H]azidopine對ABCB1的光結(jié)合性標(biāo)記，共聚焦顯微鏡結(jié)果也顯示FG020326直接與ABCB1結(jié)合發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用；ATPase活性實(shí)驗(yàn)則顯示FG020326濃

12、度依賴性地抑制ABCB1ATPase活性，表明FG020326可能不是ABCB1底物。體內(nèi)逆轉(zhuǎn)MDR研究表明FG020326(100mg/kg，p.o)與紫杉醇(18mg/kg，i.p)聯(lián)合可以顯著增加紫杉醇對以KBv200細(xì)胞建立的裸鼠移植瘤的抗腫瘤活性，抑瘤率為51.7％，而與生理鹽水對照組相比，F(xiàn)G020326或紫杉醇單獨(dú)用藥則無明顯抑瘤作用，重要的是聯(lián)合用藥組未見明顯增加紫杉醇的毒副作用。FG020326(100mg/kg，p.

13、o)無論是先于紫杉醇(18mg/kg，i.v)1h灌胃還是和紫杉醇同時(shí)尾靜脈注射(FG020326，30mg/kg，p.o，紫杉醇，18mg/kg，i.v)均對紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)無顯著影響。 下調(diào)ABCB1表達(dá)也可逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的MDR，但FG020326不影響ABCB1在KBv200細(xì)胞中的表達(dá)；FG020326對ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介導(dǎo)的MDR無明顯逆轉(zhuǎn)作用。 2.體外評價(jià)中l(wèi)apatini

14、b不僅顯著逆轉(zhuǎn)ABCG2轉(zhuǎn)染細(xì)胞對ABCG2底物米托蒽醌的耐藥性，而且顯著恢復(fù)經(jīng)藥物誘導(dǎo)表達(dá)突變型ABCG2細(xì)胞S1-M1-80對米托蒽醌和拓?fù)涮婵档乃幬锩舾行?；Lapatinib還顯著增強(qiáng)ABCB1過表達(dá)MDR細(xì)胞對阿霉素，長春新堿，紫杉醇和柔紅霉素的敏感性；重要的是，lapatinib體外顯著增加ABCB1高表達(dá)白血病患者白血病細(xì)胞對阿霉素和柔紅霉素的藥物敏感性；盡管lapatinib與阿霉素合用對MCF—7細(xì)胞，與米托蒽醌或拓?fù)涮?/p>

15、康合用對S1細(xì)胞產(chǎn)生小的協(xié)同作用，但不改變非ABCB1和ABCG2底物順鉑對MDR細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；Lapatinib對ABCC4和LRP介導(dǎo)的MDR無明顯逆轉(zhuǎn)作用. 結(jié)論： 1.FG020326在體外和體內(nèi)逆轉(zhuǎn)ABCB1介導(dǎo)的MDR，對ABCC1，ABCC4，ABCG2和LRP介導(dǎo)的MDR則無明顯逆轉(zhuǎn)作用。 2.FG020326可能不是ABCB1底物，不影響合用抗癌藥物紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)，通過與ABCB1直接作

16、用抑制ABCB1藥物外排泵功能發(fā)揮逆轉(zhuǎn)作用，是有開發(fā)前景的第三代MDR逆轉(zhuǎn)劑。 3.Lapatinib通過抑制ABCB1和ABCG2藥物外排泵功能在體內(nèi)和體外逆轉(zhuǎn)ABCB1和ABCG2介導(dǎo)的MDR，這種逆轉(zhuǎn)作用不依賴于lapatinib對EGFR和HER2酪氨酸激酶磷酸化的阻斷作用。 4.Lapatinib可能足ABCB1和ABCG2底物，影響合用紫杉醇的藥代動(dòng)力學(xué)，對于指導(dǎo)臨床聯(lián)合用藥，揭示lapatinib耐藥性的產(chǎn)

17、生提供依據(jù)。 5.Erk1/2磷酸化水平在KBv200細(xì)胞的生存中可能不起主要作用。 6.Lapatinib在體外增加ABCB1底物阿霉素和柔紅霉素對ABCB1高表達(dá)白血病患者白血病細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，為克服白血病多藥耐藥提供理論依據(jù)。 7.Lapatinib對ABCC4和LRP介導(dǎo)的MDR沒有明顯逆轉(zhuǎn)作用。 8.Sunitinib通過抑制ABCG2藥物外排泵功能逆轉(zhuǎn)ABCG2介導(dǎo)的MDR.對指導(dǎo)sunit