Ophiobolin O通過周期阻滯和凋亡在體內(nèi)外逆轉(zhuǎn)耐藥細(xì)胞MCF-7-ADR的機(jī)制研究.pdf

1、越來越多的臨床和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，乳腺癌為我國常見惡性腫瘤之一，也是我國惡性腫瘤防治研究的重點(diǎn)。死亡率在惡性腫瘤中居第二位，僅次于胃癌和食管癌。手術(shù)切除是目前治療早期乳腺癌唯一有效的方法，但大多數(shù)患者就診時(shí)已達(dá)病程中晚期，手術(shù)療效受限，因而尋找新的治療方法尤為重要。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生機(jī)制的深入研究，探討誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的方法成為提高臨床療效的新思路。目前臨床上治療腫瘤出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，多藥耐藥(MDR)系指腫瘤細(xì)胞對(duì)1種抗腫瘤藥物出

2、現(xiàn)耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)不同、作用靶位不同的抗腫瘤藥物也有耐藥性。隨著腫瘤化療藥物的廣泛應(yīng)用，腫瘤的耐藥性問題越來越突出，已成為腫瘤有效治療的主要障礙之一。目前研究腫瘤耐藥機(jī)制主要是從MDR基因表達(dá)的產(chǎn)物入手，探討此類產(chǎn)物引起的耐藥機(jī)制。主要有P-糖蛋白(P-gP)、細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ、Ⅱ(TOPOⅠ、Ⅱ)、多藥耐藥相關(guān)蛋白（MRP）和肺耐藥蛋白(LRP)等。
　　

3、 本課題研究一種新的化合物蛇孢假殼素(ophoiobolin)對(duì)乳腺癌耐藥細(xì)胞MCF-7/ADR的作用，蛇孢假殼素O是從中國海洋大學(xué)提供的12種微生物提取物中篩選出來的抗腫瘤活性較好的化合物，屬于蛇孢假殼素類二倍半萜化合物，其分子量為434.39。國內(nèi)外文獻(xiàn)未曾報(bào)道過這種化合物的抗腫瘤活性。本論文選取人乳腺癌耐阿霉素細(xì)胞MCF-7/ADR作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，來研究Ophiobolin O對(duì)其增殖，周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　

4、研究目的:研究Ophiobolin O對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，周期和凋亡的影響及其作用機(jī)制。
　　 研究方法:采用MTT法檢測(cè)Ophiobolin O對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7人乳腺癌耐藥細(xì)胞株MCf-7/ADR增殖的影響;采用流式細(xì)胞儀Propidium Iodide(PI)單標(biāo)法檢測(cè)Ophiobolin O對(duì)MCF-7/ADR細(xì)胞周期進(jìn)程的影響;Real-time PCR檢測(cè)耐藥基因mRNA表達(dá)的變化;采用流式細(xì)胞儀A

5、nnexin V-FITC/PI雙標(biāo)法和PI單標(biāo)的sub-G1（細(xì)胞亞二倍體凋亡峰）法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;應(yīng)用Hoechst33342和DAPI熒光染色法觀察Opho-和ADM處理后細(xì)胞形態(tài)的變化;western blotting檢測(cè)凋亡蛋白和周期表達(dá)水平;采用流式細(xì)胞儀JC-1染色法檢測(cè)線粒體膜電位（△Ψm）水平;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光探針DCFH-DA標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS);用wes

6、tern blotting檢測(cè)凋亡通路蛋白表達(dá);用NAC和ROS抑制劑檢測(cè)JC-1和ROS水平，動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ophiobolin O和ADM的抑瘤率;轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)MDR1基因啟動(dòng)子水平高低。
　　 結(jié)果:Ophiobolin O可抑制MCF-7/ADR細(xì)胞增殖，其作用具有濃度依賴性，在作用MCF-7/ADR細(xì)胞48h，后，ADMIC50為6.67±0.16μM，0.1μ M Ophiobolin O作用MCF-7/AD

7、R細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期進(jìn)程和sub-G1的結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著濃度的增高，G2/M期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸增多(p＜0.05)，而S期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)逐漸減少(p＜0.05)，G0/G1期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)基本保持不變，表明Ophiobolin O+ADM阻滯細(xì)胞于G2/M期，說明Ophiobolin O具有誘導(dǎo)MCF-7/ADR細(xì)胞凋亡的作用。流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙標(biāo)檢測(cè)凋亡率的結(jié)果也顯示隨著藥物作用時(shí)間的延長，早期凋亡細(xì)

8、胞(Annexin V+/PI-)占總細(xì)胞數(shù)的比例也不斷增加(p＜0.05)，進(jìn)一步證明Ophiobolin O具有誘導(dǎo)MCF-7/ADR凋亡的作用。通過熒光染料Hoechst33342和DAPI檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的結(jié)果顯示Ophiobolin O作用MCF-7/ADR細(xì)胞48h后可見典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為部分細(xì)胞胞質(zhì)縮小，胞質(zhì)濃縮，核染色體高度凝聚、邊緣化，細(xì)胞核碎裂呈碎片狀，可見典型的新月形凋亡小體，而正常對(duì)照組的細(xì)胞核完整。