Tat轉導肽對內含反義RNA病毒樣顆粒和siRNA的轉運及對HCV抑制作用的研究.pdf

1、目的： 通過Tat47-57轉導肽轉運內含反義RNA的MS2 VLPs和siRNA，為MS2 VLPs作為藥物載體進行探討，以及為siRNA的細胞內轉運提供新方法。 方法： 將編碼MS2成熟酶蛋白和衣殼蛋白的序列插入pET28(b)載體，構建包裝載體pET-MS2，并將該載體與pACYC-HIV質粒共同轉入感受態(tài)E.Coli BL21(DE3)，篩選陽性菌落，用IPTG誘導表達16hr，超聲波碎菌，形成MS2 V

2、LPs。經過CsCl密度梯度離心純化后用于交聯。 通過化學合成的方法獲得Tat47-57轉導肽，在交聯劑Sulfo-SMPB作用下，等摩爾比的Tat47-57轉導肽與MS2 VLPs交聯，形成Tat-MS2 VLPs交聯物。與Hela細胞孵育6 hr，通過FITC直接標記VLPs或間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下觀察結果。 從人HCV陽性血清中提取HCV RNA，RT-PCR擴增獲得HCV 5’UTR和IRES序列，反向插入

3、pACYCDuet-1表達載體，形成pACYC-HCV質粒，同時構建正向插入載體的陰性對照。pACYC-HCV質粒與pET-MS2包裝載體同時轉入感受態(tài)E.Coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達16 hr，超聲波碎菌，形成內含反義RNA的MS2VLPs。經過CsCl密度梯度離心純化，RT-PCR鑒定VLPs，然后與等摩爾比的Tat47-57轉導肽交聯，交聯物與含HCV-螢光素酶報告基因的Huh-7細胞孵育，24 hr后檢測細胞內

4、螢光素酶活性。 利用Tat47-57轉導肽轉運針對HCV Con 1b 5’UTR區(qū)的siRNA。在交聯劑Sulfo-SMPB作用下，等摩爾比的Tat47-57轉導肽與siRNA交聯，形成Tat-siRNA交聯物。分別取含0.5μg、1.0μg和1.5μg的交聯物與含HCV復制子的Huh-7細胞孵育24 hr，在熒光顯微鏡下觀察細胞攝取結果，檢測螢光素酶活性，用實時(real-time)熒光定量PCR方法檢測細胞中HCV RNA

5、的濃度。同時用Lipofectamine 2000轉染1.0μg的siRNA，作為對照。 結果： 利用雙質粒表達系統(tǒng)，MS2衣殼蛋白成功的包裝了外源RNA，形成了MS2VLPs，與Tat47-57轉導肽化學交聯后轉入了Hela細胞，用FITC直接標記VLPs或間接免疫熒光法在熒光顯微鏡下均可以觀察到發(fā)黃綠色熒光的細胞。 將內含反義RNA的MS2 VLPs與Tat47-57轉導肽通過交聯劑Sulfo-SMPB交聯后

6、，在轉導肽的作用下VLPs轉入了含HCV-螢光素酶報告基因的Huh-7細胞。并且在細胞內反義RNA下調了螢光素酶的表達。 Tat47-54轉導肽和HCV 5’UTR區(qū)siRNA的交聯物與含HCV復制子的Huh-7細胞孵育24-48 hr后，在熒光顯微鏡下可以觀察到發(fā)紅色熒光的細胞。裂解細胞，檢測螢光素酶活性及對HCV RNA濃度定量檢測結果說明，與對照相比較，不同劑量的交聯物均可抑制螢光素酶活性，并且隨劑量的增加抑制作用也相應增

7、強。 結論： 采用化學交聯法將HIV-1 Tat47-57轉導肽和MS2 VLPs交聯，為轉運MS2 VLPs進入細胞提供了新方法。 利用雙質粒表達系統(tǒng)形成的內含針對HCV 5’UTR和IRES區(qū)反義RNA的MS2VLPs，在Tat47-57轉導肽作用下成功的轉入了Huh-7細胞，而且包裝的反義RNA下調了靶基因的表達。通過該研究，為反義RNA和MS2 VLPs的轉運提供了新方法。 通過化學交聯形成Tat