溶栓新藥瑞替普酶(Reteplase)變復(fù)性及分離純化的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、瑞替普酶(Reteplase)是第三代溶血栓藥物,該產(chǎn)品在臨床上更具有藥物半衰期長、溶栓作用強、副作用小等優(yōu)點。Reteplase是組織型纖溶酶原激活劑的衍生體,在原分子結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行了功能域的刪除,保留了kringle II,蛋白酶兩個功能域及N端的3個氨基酸。該重組突變體是單鏈非糖基化蛋白,由355個氨基酸組成,分子量約為39kD,含有9對二硫鍵。 選用E.coli作為表達系統(tǒng),目的蛋白能夠在很短時間內(nèi)實現(xiàn)高水平表達,

2、但表達產(chǎn)物在胞內(nèi)以無活性的聚集物一包涵體的形式存在。首先高密度發(fā)酵重組E.coli工程菌生產(chǎn)包涵體,其中IPTG的誘導(dǎo)是關(guān)鍵的一步。誘導(dǎo)條件的優(yōu)化既可以誘導(dǎo)蛋白最大限度的表達,又避免了過高的IPTG的濃度對工程菌的毒害作用。在IPTG的誘導(dǎo)下表達重組蛋白時,這些重組蛋白質(zhì)會在細胞內(nèi)凝集,形成無活性的包涵體顆粒。超聲裂解離心后得到的包涵體除含有目的蛋白外,還有一些核酸,雜蛋白和膜蛋白,包涵體的純度直接影響到后續(xù)變性與復(fù)性的效果,因此要獲得

3、純化的有活性的Reteplase,首先要提取和純化包涵體。低濃度的變性劑例如尿素可以除去包涵體上的一些膜蛋白等雜質(zhì),但是純化程度還是有一定的限制,應(yīng)用鹽沈一尿素洗一水洗三次連續(xù)的洗滌純化方法能在相當(dāng)程度上提高包涵體的純度,變性效果也有所提高。 變性的目的是將致密的包涵體打開,使沒有生物學(xué)活性的Reteplase轉(zhuǎn)為具有活性的蛋白質(zhì),以提高重組蛋白的復(fù)性率,降低生產(chǎn)成本。由于Reteplase分子中的l8個cys要形成9對

4、二硫鍵,所以利用E.coli表達Reteplase時,往往會發(fā)生二硫鍵的錯配,這也是包涵體形成的原因之一。所以溶解包涵體的時候要加入適當(dāng)?shù)淖冃砸阂源蚱扑械亩蜴I,不同的變性液對包涵體的溶解作用是不同的。經(jīng)試驗比較,采用變性液(50 mmol/LTris,1mmol/L EDrrA,8 mol/L尿素,150 mmol/Lβ-巰基乙醇,pH 9.0)能使包涵體徹底溶解,有利于隨后的再折疊。影響重組蛋白復(fù)性的因素很多,根據(jù)Reteplas

5、e的特點,考慮了蛋白濃度,復(fù)性時間,復(fù)性溫度對復(fù)性效果的影響。我們采用稀釋復(fù)性法,實驗結(jié)果表明,最適的復(fù)性液是0.1 mol/LTris,1mmol/LEDTA,1 mmol/LGSH,0.2mmol/L GSS G,0.5 mol/L L-Arg,pH=10.5,尿素的終濃度為1.5mol/L。稀釋后在室溫下靜置24h。 采用ETI親和層析法對復(fù)性后的Reteplase進行純化,ETI是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑類,而Retepl

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