WNT6基因低表達(dá)對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖的影響.pdf

1、目的:研究WNT6基因?qū)θ橄侔㎝DA-MB-231細(xì)胞系生長(zhǎng)增殖的影響，分析WNT6基因在三陰性乳腺癌發(fā)生中的作用，為探討三陰性乳腺癌發(fā)病的分子機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:選取三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系為研究對(duì)象，針對(duì)WNT6基因，設(shè)計(jì)三個(gè)不同序列的特異性 siRNA( siRNAl、 siRNA2、 siRNA3)，另外設(shè)計(jì)不含目的基因的siRNA（scramble siRNA，scRNA）；利用脂質(zhì)體Lipo

2、fectamin2000將siRNA分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞系，運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)WNT6基因的表達(dá)情況，選擇沉默效應(yīng)最好的一組 siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；以未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染 scRNA的MDA-MB-231細(xì)胞系作為對(duì)照，運(yùn)用RT-PCR和Western blot方法，檢測(cè)MDA-MB-231細(xì)胞系WNT6基因在mRNA及蛋白質(zhì)水平的表達(dá)；MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，分析 WNT

3、6基因表達(dá)降低對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞系生長(zhǎng)、增殖的影響；軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，觀察各組細(xì)胞非停泊依賴性生長(zhǎng)情況。
　　結(jié)果：與未轉(zhuǎn)染的MDA-MB-231細(xì)胞系比較，siRNAl、 siRNA2、 siRNA3分別轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞系后，RT-PCR檢測(cè)WNT6基因mRNA的表達(dá)水平明顯降低，分別降低約50％(p<0.01)、40%(p<0.05)和20%(p<0.05)；Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示：wnt6蛋

4、白的表達(dá)水平也明顯降低，分別比對(duì)照組降低約45%(p<0.01)、28%(p<0.05)和10%(p>0.05)，表明siRNAl對(duì)WNT6基因的沉默效果最好，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選轉(zhuǎn)染 siRNAl的MDA-MB-231細(xì)胞系為實(shí)驗(yàn)組；以未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染scRNA的MDA-MB-231細(xì)胞系作為對(duì)照組，通過RT-PCR、Western Blot檢測(cè)分析WNT6基因在各組MDA-MB-231細(xì)胞系中的表達(dá)情況，結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組WNT

5、6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均分別下調(diào)近50%和40%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；scRNA組與未轉(zhuǎn)染組比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。MTT法繪制生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染48h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度受到明顯抑制，細(xì)胞增殖率降低約48%；轉(zhuǎn)染72h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖率降低約49%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)；scRNA組與未轉(zhuǎn)染組比較細(xì)胞增殖率差異無(wú)顯著性(p>0.05)。細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組集落形成率