中藥香加皮杠柳苷抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖的體內(nèi)外實驗研究.pdf

1、目的:研究中藥香加皮提取物杠柳苷(periplocin extracted from cortexperiplocae,CPP)對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231凋亡及侵襲的影響以及其體內(nèi)的抗腫瘤效應(yīng),分析杠柳苷對MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)stat3表達(dá)的影響和stat3相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用,研究杠柳苷的抗腫瘤作用機制,為CPP作為臨床抗腫瘤新藥開發(fā)提供實驗依據(jù)。
　　 方法:
　　 1、應(yīng)用用四甲基偶氮唑藍(lán)法(MTT

2、)檢測不同濃度CPP(0.625、1.25、2.5、5、10、20μg/ml),處理不同時間(24h、48h和72h)對MDA.MB-231細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用。
　　 2、光鏡下觀察CPP處理前后細(xì)胞形態(tài)的變化;瑞姬染色觀察CPP作用后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3、采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測CPP(2.5μg/ml)作用后細(xì)胞p-Stat3的表達(dá);
　　 4、采用細(xì)胞劃痕實驗檢測CPP(2.5μg/ml)處理前后細(xì)

3、胞侵襲能的變化。
　　 5、采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(revers transcription PCR,RT-PCR)半定量檢測CPP(2.5μg/ml)作用不同時間(0h、6h、12h和24h),MDA-MB-231細(xì)胞基因stat3、IL-8的表達(dá)變化。
　　 6、采用ELISA法檢測CPP(2.5μg/ml)作用MDA-MB-231后,細(xì)胞IL-6的分泌變化。
　　 7、CPP人乳腺癌細(xì)胞細(xì)胞MDA-MB-

4、231荷瘤裸鼠抑瘤作用及對STAT3信號通路的影響。用PBS液洗滌,并將MDA-MB-231細(xì)胞密度調(diào)至5×106/ml,在裸鼠右側(cè)背部皮下接種MDA-MB-231細(xì)胞(0.2 ml含106個),建立MDA.MB-231細(xì)胞荷瘤裸鼠模型,隨機分為2組,每組10只。實驗組瘤旁注射CPP(30mg/kg)0.2ml,每日一次,對照組織給予0.2ml PBS緩沖液瘤旁注射。觀察裸鼠及腫瘤的生長情況,每3天測定一次腫瘤大小。給藥處理12天后,引

5、頸處死裸鼠,摘取腫瘤組織,分別稱瘤重,測量腫瘤體積,計算抑瘤率。采用RT-PCR技術(shù)檢測實驗組及對組腫瘤組織中stat3的表達(dá),采用Western blot方法檢測腫瘤組織p-stat3的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、CPP在0.625-20μg/ml濃度范圍內(nèi)能明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231體外增殖反應(yīng),抑制率呈現(xiàn)濃度和時間依賴性,隨著濃度和作用時間增加,對細(xì)胞增殖的抑制率升高,其中20μg/ml杠柳苷作用

6、72小時的抑制率最高為70.25％。不同濃度杠柳苷對MDA-MB-231細(xì)胞的抑制率的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜O.05)。
　　 2、CPP作用MDA-MB-231細(xì)胞后形態(tài)發(fā)生了凋亡前期改變,細(xì)胞變圓,細(xì)胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)疏松,核碎裂,胞質(zhì)染色變淺,而對照組細(xì)胞間細(xì)胞呈梭形,形態(tài)不規(guī)則,胞質(zhì)深藍(lán)色,細(xì)胞核較大,不規(guī)則,可見多個核仁。
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)分析結(jié)果顯示,MDA-MB-231細(xì)胞p-Stat3蛋白主要定位于

7、細(xì)胞核,呈棕黃色顆粒狀。CPP作用后,p-Stat3的的表達(dá)率和水平下降(p＜0.05)。
　　 4、細(xì)胞劃痕實驗分析結(jié)果顯示,CPP作用細(xì)胞后,MDA-MB-231細(xì)胞其體外侵襲能力下降。
　　 5、半定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示,隨著CPP處理時間的延長,不同處理時間組(0h、6h、12h和24h)細(xì)胞基因stat3、IL-8 mRNA表達(dá)水平逐漸降低,與未處理組(0h)細(xì)胞比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。<

8、br>　　 6、ELISA分析結(jié)果顯示,與對照組相比,CPP(2.5μg/ml)作用24小時后,MDA-MB-231細(xì)胞細(xì)胞分泌IL-6量為230.4±3.4pg/ml,較對照組512.2±5.3pg/ml明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜O.05)。
　　 7、建立人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,成瘤率100％。與對照組相比,實驗組裸鼠腫瘤生長緩慢。實驗組腫瘤重量和體積明顯低于對組織(p＜0.05),實驗組

9、平均瘤腫瘤重量1.437±0.398g,對照組腫瘤重量為3.458±0.675g,抑瘤率分別為58.44％。RT-PCR結(jié)果顯實驗組腫瘤細(xì)胞stat3表達(dá)水平明顯低于對照組(p＜0.05)。Western blot檢測結(jié)果顯示,實驗組腫瘤組織p-Stat3蛋白的表達(dá)低于對照組。
　　 結(jié)論:
　　 1、CPP在一定濃度范圍內(nèi),能夠明顯抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖,具有明顯的時間和劑量依賴性。
　　 2

10、、CPP可誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231產(chǎn)生凋亡形態(tài)學(xué)改變;
　　 3、CPP可抑制MDA-MB-231細(xì)胞Stat3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,降低MDA-MB-231細(xì)胞中酪氨酸磷酸化Stat3水平。
　　 4、CPP作用后,杠柳苷能顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞增殖及侵襲,其作用機制可能是通過抑制細(xì)胞自分泌IL-6及stat3的磷酸化阻斷stat3信號通路,下調(diào)IL-8的表達(dá)有關(guān)。
　　 5、CPP對人乳腺癌細(xì)胞