P2Y12受體自發(fā)激活及Gi和G12-13通路在血小板激活和血栓形成中的作用.pdf

1、第一部分: P2Y12受體自發(fā)激活在血小板激活和血栓形成中的作用
　　隨著生活水平的提高，動(dòng)脈血栓性疾病如冠心病和中風(fēng)等已成為嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的重要疾病。血小板異常激活引起的血管內(nèi)血栓形成是這類(lèi)疾病的病理基礎(chǔ)，抗血小板藥對(duì)于冠心病和中風(fēng)的治療效果是肯定的，但其治療效果仍未盡如人意。目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗血小板藥有環(huán)氧化酶抑制劑阿司匹林，P2Y12受體拮抗劑氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、替卡

2、雷洛(ticagrelor)和血小板纖維蛋白原受體拮抗劑等。阿司匹林是評(píng)價(jià)抗血栓藥物療效的金標(biāo)準(zhǔn)。雖然臨床試驗(yàn)顯示氯吡格雷總體療效優(yōu)于阿司匹林，但該藥對(duì)于冠心病和中風(fēng)的療效不超過(guò)50％。而血小板纖維蛋白原受體拮抗劑抗血小板作用更強(qiáng)，但隨之而來(lái)的出血等副作用也相應(yīng)增加。所以，我們?nèi)孕枰饔酶鼜?qiáng)但副作用更小的抗血小板藥物。
　　作為血小板P2Y12受體拮抗劑，氯吡格雷對(duì)冠心病和中風(fēng)病人的治療效果毋庸置疑。但臨床上部分病人的血小板對(duì)氯吡

3、格雷無(wú)反應(yīng)，即氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance)，造成氯吡格雷部分臨床治療失敗。我們認(rèn)為尚未發(fā)現(xiàn)的血小板ADP受體P2Y12突變引起的P2Y12受體自發(fā)激活可能是部分病人氯吡格雷抵抗的原因。因?yàn)槲覀円酝难芯堪l(fā)現(xiàn)，當(dāng)ADP受體P2Y12的羧基端部分被相應(yīng)的P2Y1受體取代(cP2Y12)并穩(wěn)定表達(dá)在CHO-K1細(xì)胞時(shí)，能夠表現(xiàn)出很強(qiáng)的自發(fā)激活活性并維持對(duì)激動(dòng)劑的正常反應(yīng)，利用此細(xì)胞系我們發(fā)現(xiàn)氯吡格雷是一個(gè)弱的P

4、2Y12反向激動(dòng)劑，這一特性決定了其對(duì)自發(fā)激活的血小板P2Y12受體僅有微弱的抑制作用，從而導(dǎo)致了臨床治療上的氯吡格雷抵抗。與此同時(shí)，利用此細(xì)胞系我們還發(fā)現(xiàn)了一種具有很強(qiáng)的反向激動(dòng)劑活性的P2Y12受體拮抗劑AR-C78511。
　　在本研究中，我們利用Tet-on系統(tǒng)建立了一種血小板特異性表達(dá)自發(fā)激活的cP2Y12受體的轉(zhuǎn)基因小鼠。強(qiáng)力霉素可以特異性地在骨髓巨核細(xì)胞和血小板中誘導(dǎo)高水平的轉(zhuǎn)基因cP2Y12的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠的血小

5、板對(duì)ADP、2MeSADP、AYPGKF、U46619和thrombin等血小板激活誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)明顯增強(qiáng)，表現(xiàn)出血小板的高反應(yīng)性。轉(zhuǎn)基因小鼠的靜息態(tài)血小板內(nèi)cAMP濃度降低，且可被AR-C78511逆轉(zhuǎn)，證實(shí)了轉(zhuǎn)基因小鼠血小板P2Y12受體的自發(fā)激活活性和AR-C78511的反向激動(dòng)劑活性。轉(zhuǎn)基因小鼠的出血時(shí)間縮短，氯化鐵誘導(dǎo)的腸系膜動(dòng)脈血栓形成更快、更穩(wěn)定。這些結(jié)果提供了P2Y12受體自發(fā)激活易發(fā)血栓的直接證據(jù)，在血小板水平上

6、進(jìn)一步證實(shí)了AR-C78511的反向激動(dòng)劑活性，支持AR-C78511作為新型抗血小板藥用于血栓性疾病的預(yù)防、治療具有治療學(xué)優(yōu)勢(shì)。AR-C78511因其強(qiáng)反向激動(dòng)劑活性應(yīng)該具有比氯吡格雷更好的抗血小板、抗血栓作用，因此本研究為將AC-C78511研發(fā)為新型的抗血小板藥奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分Gi和G12/13信號(hào)通路在血小板激活中的作用
　　在多種生理和病理性刺激物的作用下，血小板能夠被激活并發(fā)生粘附、變形、聚集、顆粒釋放

7、和血栓素A2合成等過(guò)程而最終導(dǎo)致生理性止血或病理性血栓形成。血小板激活在生理性止血和病理性血栓形成中起重要作用:血管損傷時(shí)血小板激活參與損傷修復(fù)反應(yīng)，對(duì)于生理止血過(guò)程十分重要;血小板異常激活導(dǎo)致的動(dòng)脈血栓形成導(dǎo)致的血管狹窄或閉塞，致使機(jī)體組織局部缺血或供血中斷是冠心病、急性冠脈綜合征、中風(fēng)等動(dòng)脈血栓性疾病的病理基礎(chǔ)。經(jīng)過(guò)幾十年的基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)踐證明抑制血小板激活的抗血小板藥對(duì)冠心病、中風(fēng)的預(yù)防、治療效果肯定，而研究血小板激活機(jī)制可以為

8、研發(fā)抗血小板藥物提供理論基礎(chǔ)。
　　G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）是一大類(lèi)膜蛋白受體的統(tǒng)稱，具有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)。研究顯示G蛋白偶聯(lián)受體能結(jié)合細(xì)胞周?chē)h(huán)境中的多種化學(xué)物質(zhì)從而激活細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，最終引起細(xì)胞狀態(tài)的改變。凝血酶、TXA2、ADP、腎上腺素、SFLLRN、AYPGKF、膠原等都能直接或間接通過(guò)激活G蛋白偶聯(lián)受體而激活血小板;和GPCR偶聯(lián)、介導(dǎo)GPCR激活血小

9、板的G蛋白有Gq、 Gi和G12/13等。已有研究證實(shí)Gq和Gi信號(hào)通路或者Gq和G12/13信號(hào)通路同時(shí)激活時(shí)都能夠引起血小板完全激活并發(fā)生聚集。雖然已有一些研究表明Gi和G12/13信號(hào)通路同時(shí)激活能夠引起血小板GPⅡb/Ⅲa激活和血小板聚集，但這一理論是否正確仍存在爭(zhēng)議。
　　我們應(yīng)用多種激動(dòng)劑在小鼠、大鼠和人的血小板上對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示:當(dāng)?shù)蜐舛鹊难“寮?dòng)劑雖然可引起Gi和G12/13的同時(shí)激活，但并不能引起血

10、小板激活和聚集，只有當(dāng)激動(dòng)劑濃度較高時(shí)血小板才發(fā)生聚集;當(dāng)血小板激動(dòng)劑濃度增加時(shí)，血小板內(nèi)Akt和Erk1/2的磷酸化水平升高;PI3k抑制劑LY294002、Akt抑制劑SH-6和PKC抑制劑Ro31-8220能夠顯著抑制血小板聚集，因而PI3k/Akt/Erk和PKC通路在Gi和G12/13信號(hào)通路協(xié)同作用誘導(dǎo)的血小板聚集中起到重要作用;而Rho激酶抑制劑Y-27632、Src家族激酶抑制劑PP2及細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑BAPTA-AM