論文一：V型并指（趾）小鼠模型建立及形態(tài)學(xué)分析論文二：成骨不全癥致病突變譜研究.pdf

1、第一部分、Ⅴ型并指（趾）小鼠模型的建立及形態(tài)學(xué)分析
　　并指是一種因肢端發(fā)育期間相鄰的手指和/或腳趾間的連接無(wú)法正常分離，而引起的肢端畸形。并指是一種最常見(jiàn)的遺傳性肢端畸形，新生兒中的發(fā)病率為0.30‰～1‰。其中Ⅴ型并指患者手部畸形特征表現(xiàn)為4-5掌骨融合，其它主要表現(xiàn)為2-5指尺側(cè)偏位及遠(yuǎn)節(jié)指骨短小、3-4或4-5并指、第5指短小或彎曲、屈指和中遠(yuǎn)指節(jié)間關(guān)節(jié)褶消失;足部畸形共同表現(xiàn)為:趾骨外翻，跖骨內(nèi)翻，第1趾（跖）骨粗大，第

2、2-5趾（跖）骨發(fā)育不良，第5趾（跖）骨短。Ⅴ型并指呈常染色體顯性遺傳，在本課題組的早期工作中，曾在一個(gè)中國(guó)人Ⅴ型并指大家系中發(fā)現(xiàn)了HOXD13基因內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)義突變。在這個(gè)Ⅴ型并指家系中，所有患者存在HOXD13基因內(nèi)錯(cuò)義突變c.950A＞G(Q317R);該突變位于HOXD13蛋白的同源結(jié)構(gòu)域(Homeobox domain，HD)內(nèi)，導(dǎo)致HD第50位的谷氨酰胺變?yōu)榫彼?。體外實(shí)驗(yàn)表明該突變導(dǎo)致其與DNA特異性結(jié)合能力的下降。HOXD

3、13是同源盒轉(zhuǎn)錄因子家族（HOX基因家族）的重要成員之一，在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育的模式形成中具有重要作用。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上以HOXD13基因突變Q50R為切入點(diǎn)，借助TALEN（轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶）技術(shù)構(gòu)建Hoxd13Q50R突變體小鼠模型，擬通過(guò)對(duì)模型小鼠進(jìn)行表型分析及分子生物學(xué)分析，明確Hoxd13基因突變與肢端畸形的相關(guān)性，闡明Ⅴ型SD的致病機(jī)制。目前，外觀觀察和骨骼CT結(jié)果顯示Hoxd13Q50R雜合、純合突變小鼠肢

4、端外形和骨骼形態(tài)均有明顯畸形，說(shuō)明HOXD13基因內(nèi)HD-Q50R突變是導(dǎo)致人Ⅴ型并指（趾）的致病原因。
　　第二部分、成骨不全癥致病突變譜研究
　　成骨不全癥俗稱脆骨病。成骨不全患者的骨骼較脆弱易骨折，但表型的嚴(yán)重性有顯著差異。成骨不全還具有骨骼畸形、牙本質(zhì)發(fā)育不全、耳聾及淺灰色或藍(lán)色鞏膜等表型。目前，已知的成骨不全癥致病基因共有十三種，90％以上的OI患者由編碼Ⅰ型膠原的COL1A1和COL1A2的雜合突變引起。剩下患者

5、可能的致病原因有:某些基因中的致病改變引起了骨骼過(guò)度礦化或礦化不足，或影響了Ⅰ型膠原的轉(zhuǎn)錄后修飾、折疊、分泌、加工，還有可能是因成骨細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的基因出現(xiàn)了致病改變。本研究中綜合運(yùn)用PCR-DNA測(cè)序、二代測(cè)序、多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(multiplexligation-dependent probe amplification，MLPA)對(duì)成骨不全癥致病基因進(jìn)行突變研究。酚/氯仿法提取先證者、家系成員外周全血基因組DNA，二代測(cè)序或PC

6、R擴(kuò)增COL1A/A2編碼區(qū)及外顯子/內(nèi)含子交界區(qū)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行sanger測(cè)序。對(duì)于未發(fā)現(xiàn)突變的患者考慮拷貝數(shù)變異，利用MLPA技術(shù)(P271/P272)對(duì)COL1A1/A2進(jìn)行重復(fù)和缺失突變篩查。最后，對(duì)COL1A1/A2也未檢測(cè)到拷貝數(shù)變異的患者，對(duì)成骨不全隱性致病基因進(jìn)行PCR-sanger測(cè)序篩查突變。本研究中，我們共在200例成骨不全癥家系中，檢出COL1A1/A2點(diǎn)突變及微缺失突變132例（COL1A1突變78例，COL