HCN2基因轉(zhuǎn)染脂肪干細(xì)胞自體移植治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本課題將細(xì)胞移植與基因治療相結(jié)合，構(gòu)建HCN2重組腺病毒載體Ad.HCN2并體外轉(zhuǎn)染豬脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)以構(gòu)建起搏細(xì)胞，并自體移植以有效起搏心室，從而治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯。
　　 方法:
　　 (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 獲取實(shí)驗(yàn)豬頸部脂肪組織，0.075％Ⅱ型膠原酶分離得到ADSCs，將ADSCs培養(yǎng)于完全DMEM培養(yǎng)基中，每7

2、2 h換液1次，細(xì)胞融合達(dá)90％傳代培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并檢測(cè)細(xì)胞周期；通過(guò)CD29、CD34、CD44、CD45、HLA-DR和c-kit的流式細(xì)胞儀檢測(cè)和免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志；將ADSCs置入成脂肪、成骨、成軟骨、成肝細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)分化并鑒定分化細(xì)胞的性質(zhì)。
　　 (二)Ad.HCN2的構(gòu)建及其檢測(cè)
　　 擴(kuò)增目的基因HCN2，構(gòu)建重組質(zhì)粒pShuttleCMV.HCN2

3、并行PCR和基因測(cè)序檢測(cè)；應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法制備重組腺病毒Ad.HCN；將Ad.HCN2擴(kuò)增、純化并行滴度測(cè)定；HeLa細(xì)胞檢測(cè)確定其使用安全性；Ad.GFP以不同感染倍數(shù)(multiplication ofinfection，MOI)轉(zhuǎn)染ADSCs后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，確定最佳MOI；檢測(cè)Ad.GFP轉(zhuǎn)染ADSCs表達(dá)強(qiáng)度并繪制時(shí)間曲線；檢測(cè)Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后細(xì)胞活力與細(xì)胞周期變化；繪制轉(zhuǎn)染Ad.HCN2、Ad.Null以及

4、未轉(zhuǎn)染ADSCs的生長(zhǎng)曲線，對(duì)比明確Ad.HCN2的安全性。
　　 (三)Ad.HCN2轉(zhuǎn)染豬ADSCs構(gòu)建起搏細(xì)胞
　　 Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后，RT-PCR檢測(cè)HCN2 mRNA表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)HCN2通道蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)HCN2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞百分比；Western-blot檢測(cè)HCN2蛋白；全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)行電生理學(xué)檢測(cè)；分離培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞(neonatal rat'scardiomyocytes

5、，NRCs)并行免疫組織化學(xué)鑒定；聯(lián)合培養(yǎng)ADSCs和NRCs，觀察細(xì)胞搏動(dòng)情況并記錄收縮頻率；加入異丙腎上腺素后觀察細(xì)胞收縮頻率變化；將Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng)后，行抗縫隙連接蛋白43(Connexin43，Cx43)免疫熒光染色。
　　 (四)起搏細(xì)胞自體移植治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯
　　 實(shí)驗(yàn)豬植入心臟電子起搏器后，射頻消融希氏束建立完全性房室傳導(dǎo)阻滯動(dòng)物模型；于右心室前壁自體移植ADSCs；

6、術(shù)后常規(guī)行體表心電圖和24 h動(dòng)態(tài)心電圖檢查；分別注射異丙腎上腺素和阿托品以觀察實(shí)驗(yàn)豬心率對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的反應(yīng)性；獲取細(xì)胞移植部位心室肌，分別行HE染色觀察和免疫熒光檢測(cè)。
　　 結(jié)論:
　　 (一)豬ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定
　　 ADSCs來(lái)源廣泛，脂肪組織抽取后殘留于供區(qū)的脂肪組織仍可擴(kuò)增，容易大量獲得，對(duì)供區(qū)損傷小。ADSCs的分離效率較其他干細(xì)胞高，擴(kuò)增能力強(qiáng)，傳代培養(yǎng)易于獲得大量有分化能力的細(xì)胞。AD

7、SCs表達(dá)CD29和CD44，顯示其具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性；ADSCs不表達(dá)CD34、CD45、c-kit，證明其為非造血類(lèi)細(xì)胞。而其MHCⅡ相關(guān)蛋白HLA-DR近不表達(dá)，說(shuō)明它們具有極少量與移植排斥相關(guān)的抗原分子，提示ADSCs具有免疫逃逸特性，具備異體移植的可能性。成脂、成骨、成軟骨及成肝細(xì)胞誘導(dǎo)結(jié)果證明ADSCs是具有多向分化能力的干細(xì)胞。
　　 (二)Ad.HCN2的構(gòu)建及其檢測(cè)
　　 構(gòu)建的重組腺病毒攜帶目的基因

8、HCN2。HeLa細(xì)胞未出現(xiàn)CPE，說(shuō)明制備的重組腺病毒中未混有野生型病毒，體外轉(zhuǎn)染安全。MOI=50的Ad.GFP轉(zhuǎn)染率較高，且細(xì)胞狀態(tài)好，為了達(dá)到最佳量效比，后期實(shí)驗(yàn)均選擇MOI=50作為標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)染倍數(shù)。Ad.GFP轉(zhuǎn)染ADSCs后，目的基因表達(dá)隨時(shí)間改變逐漸增強(qiáng)，在7 d左右表達(dá)強(qiáng)度最高，之后隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降。Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs細(xì)胞活力和細(xì)胞周期無(wú)變化，Ad.HCN2對(duì)ADSCs無(wú)毒副作用。
　　 (三)Ad

9、.HCN2轉(zhuǎn)染豬ADSCs構(gòu)建起搏細(xì)胞
　　 RT-PCR正實(shí)Ad.HCN2轉(zhuǎn)染ADSCs后，細(xì)胞內(nèi)有HCN2 mRNA合成。保溫試驗(yàn)證實(shí)我們提取的RNA樣品純度高，可以滿足進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)要求。Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs可表達(dá)HCN2基因。免疫熒光提示轉(zhuǎn)染細(xì)胞有HCN2蛋白表達(dá)，其表達(dá)后功能區(qū)域位于細(xì)胞膜。流式細(xì)胞儀檢測(cè)提示Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs細(xì)胞膜上HCN2通道蛋白的高表達(dá)。Western-blot檢測(cè)結(jié)果說(shuō)明Ad.

10、HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs后可高效表達(dá)特異性目的蛋白HCN2。全細(xì)胞膜片鉗證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞能產(chǎn)生If。ADSCs與NRCs聯(lián)合培養(yǎng)，Ad.HCN2轉(zhuǎn)染的ADSCs能有效起搏NRCs，并且對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有良好的反應(yīng)性。聯(lián)合培養(yǎng)后，ADSCs和NRCs之間可形成Cx43。
　　 (四)起搏細(xì)胞自體移植治療完全性房室傳導(dǎo)阻滯
　　 ADSCs自體移植后，起搏細(xì)胞可有效起搏心室。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物體表心電圖QRS波和起搏標(biāo)測(cè)QRS波的形態(tài)