Microdystrophin基因修飾的自體脂肪干細(xì)胞左心房移植治療DMD模型鼠的試驗(yàn)研究.pdf

1、Duchenne型肌營(yíng)養(yǎng)不良癥(Duchenne Muscular Dystrophy，DMD)是一種以骨骼肌進(jìn)行性變性、壞死為主要病理特征的X連鎖隱性遺傳性肌肉疾病，在出生活男嬰中發(fā)病率為1／3500。目前已知DMD是由編碼抗肌萎縮蛋(dystrophin)基因突變導(dǎo)致該蛋白缺失而引起發(fā)病的。患兒一般3～5歲開始出現(xiàn)臨床癥狀，12歲后喪失行走能力，常于20歲左右死于呼吸／循環(huán)衰竭。 本研究擬體外構(gòu)建帶有microdystrop

2、hin的重組桿狀病毒、擴(kuò)增、純化；體外分離、培養(yǎng)、鑒定DMD動(dòng)物模型鼠脂肪干細(xì)胞；體外重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)模型鼠脂肪干細(xì)胞并鑒定細(xì)胞活性、增殖能力、成肌分化潛能；經(jīng)基因修飾后的自體脂肪干細(xì)胞左心房注射移植DMD模型鼠；檢測(cè)細(xì)胞移植后在模型鼠體內(nèi)分布及表達(dá)microdystrophin情況，為今后臨床上建立自體脂肪干細(xì)胞基因修飾后移植治療DMD模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 材料和方法： 1.試驗(yàn)材料 1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

3、 6～10周齡mdx鼠(20～30g)共10只，隨機(jī)分2組；8～10周齡dko鼠(10～20g)共5只，隨機(jī)分2組： (1)mdx鼠對(duì)照組(4只)，dko鼠對(duì)照組(2只)：給予0.15 mL PBS左心房注射； (2)經(jīng)microdys基因修飾后的自體脂肪干細(xì)胞左心房移植mdx鼠(6只)，dko鼠(3只)。移植后的1W為觀察點(diǎn)。 1.2 試驗(yàn)試劑與器材(略) 2.試驗(yàn)方法 2.1帶有綠色熒光蛋白的桿狀病

4、毒載體(Bv-GFP)、腺病毒載體(Av-GFP)、腺相關(guān)病毒載體(AAv-GFP)、質(zhì)粒載體(pGFP)擴(kuò)增，濃度鑒定Bv-GFP由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、惠贈(zèng)。Bv-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)sf9細(xì)胞擴(kuò)增，極度稀釋法測(cè)定擴(kuò)增后的重組桿狀病毒滴度；Av-GFP于-80℃凍存，室溫復(fù)蘇后將其轉(zhuǎn)導(dǎo)293細(xì)胞以擴(kuò)增，用極度稀釋法測(cè)定擴(kuò)增后的重組腺病毒滴度；AAV2-GFP(滴度為1×1012v．g／mL)購于本元正陽基因有限公司；pGFP購

5、于Clontech公司，經(jīng)大腸桿菌擴(kuò)增的pGFP，用紫外分光光度儀測(cè)其濃度。 2.2 dko鼠鑒定 尾靜脈采血，提DNA基因鑒定；脛前肌冰凍切片，免疫組化鑒定。 2.3 DMD模型鼠脂肪干細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定 采用差速貼壁法分離、擴(kuò)增及純化mdx鼠及dko鼠脂肪干細(xì)胞(mouse adipose derived stem cells，mASCs)，并進(jìn)行表面抗原檢測(cè)和成脂、成骨分化能力鑒定，將形態(tài)一致的P

6、5～8代mASCs進(jìn)行后續(xù)的試驗(yàn)。 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone malTow derived mesenchymal stem cells，hMSCs)，SD大鼠成肌細(xì)胞(rat myoblast，rmyoblast)、脂肪干細(xì)胞(rat adipose derived stem cells,rASCs)，mdx鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mouse bone marrow derived mesenehymal stem

7、 cells,mMSCs)、成肌細(xì)胞(mouse myoblast，mmyoblast)、羊水干細(xì)胞(mouse amniotic fluid derived stem cells，mAFSs)、神經(jīng)干細(xì)胞(mouse neuron derived stem cells,mNSCs)用上述類似的方法分離、培養(yǎng)、鑒定。 2.4 基因載體Bv-GFP、Av-GFP、AAv-GFP、pGFP轉(zhuǎn)導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Bv-GFP

8、、AV-GFP、AAv-GFP在MOI值為200v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時(shí)間為4 h的條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)hMSCs；采用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)質(zhì)粒pGFP轉(zhuǎn)染hMSCs。流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測(cè)各基因載體對(duì)hMSCs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 2.5 Bv-GFP轉(zhuǎn)導(dǎo)mdx鼠不同組織干細(xì)胞 Bv-GFP在MOI值為200v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時(shí)間為4 h的條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)mdx鼠mASCs

9、、mMSCs、mmyoblast、mAFSs、mNSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bv-GFP對(duì)各細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。 2.6帶有microdystrophin基因的重組桿狀病毒(Bv-mierodys)轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠脂肪干細(xì)胞及鑒定 Bv-microdys(滴度1×1013v．g／mL)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建、惠贈(zèng)。Bv-microdys在MOI值為1000 v．g／cell、孵育溫度為25℃、孵育時(shí)間為4 h的條件下轉(zhuǎn)導(dǎo)

10、mASCs，應(yīng)用細(xì)胞間接免疫熒光、RT-PCR鑒定microdystrophin在mASCs中的表達(dá)。苔盼藍(lán)染色進(jìn)一步檢測(cè)經(jīng)Bv-microdys基因修飾的mASCs細(xì)胞活性。 2.7 Bv-microdys轉(zhuǎn)導(dǎo)大鼠脂肪干細(xì)胞后對(duì)其成肌分化潛能的影響 將經(jīng)Bv-microdys基因修飾的rASCs及對(duì)照組細(xì)胞與rmyoblast在Transwell小室共培養(yǎng)，在規(guī)定時(shí)間點(diǎn)分別進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光及RT-PCR檢測(cè)MyoD、d

11、evMHC的表達(dá)。 2.8 microdys-mASCs遷移能力檢測(cè) 應(yīng)用Transwell小室細(xì)胞遷移試驗(yàn)，分別檢測(cè)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基、TNF-β對(duì)microdys-mASCs遷移能力的影響。 2.9 microdys-mASCs移植前Hochest33258標(biāo)記 于移植前24 h將microdys-mASCs經(jīng)Hochest33258孵育半小時(shí)，并檢測(cè)胞核標(biāo)記情況。

12、 2.10脂肪干細(xì)胞左心房移植DMD模型鼠 經(jīng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基孵育6 h后的microdys-mASCs左心房移植DMD模型鼠。 2.11 microdys-mASCs心臟移植后在模型鼠體內(nèi)分布及表達(dá)microdystrophin情況 移植1W后取移植鼠和對(duì)照鼠脛前肌、膈肌、心肌，免疫組化檢測(cè)microdystrophin表達(dá)情況。 2.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS13

13、.0進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 結(jié)論： 1.重組桿狀病毒對(duì)小鼠不同組織來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率有明顯差別，其對(duì)于人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高于腺病毒、腺相關(guān)病毒、質(zhì)粒載體，且對(duì)細(xì)胞無毒性作用。 2.經(jīng)帶有microdystrophin重組桿狀病毒基因修飾后的大鼠脂肪干細(xì)胞保持成肌分化潛能。 3.經(jīng)人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)基孵育的mdx小鼠脂肪干細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)。 4.