DNA氧化損傷修復(fù)基因HOGG1低表達(dá)細(xì)胞株的建立及其應(yīng)用研究.pdf

1、DNA損傷與修復(fù)一直是毒理學(xué)和腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，在眾多DNA損傷中，以自由基(freeradical)引起的DNA氧化損傷(oxidativeDNAdamage)研究最多，被認(rèn)為是啟動和促進(jìn)腫瘤發(fā)生最為重要的因素。大量研究表明：活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)自由基可以直接攻擊生物大分子DNA，誘發(fā)DNA鏈斷裂和多種形式的堿基修飾。在各種DNA氧化損傷中，以鳥嘌呤8位碳原子的氧化最常見，其氧化產(chǎn)物8-羥基-脫

2、氧鳥嘌呤(7，8-dihydro-8-oxoguanine,8-OHdG)在體內(nèi)形成后較為穩(wěn)定、易于檢測，被公認(rèn)為DNA氧化損傷的生物標(biāo)志物(biomarker)。此外，8-OHdG最特征、最具生物學(xué)意義的危害是：DNA鏈中的鳥嘌呤G被氧化成8-OHdG后可導(dǎo)致DNA鏈空間構(gòu)象的改變，在DNA合成時(shí)8-OHdG優(yōu)先或等效率地與腺嘌呤A配對，從而導(dǎo)致DNA鏈G：C-＞T：A顛換，該顛換在腫瘤形成中發(fā)生最早，常見于癌基因ras和抑癌基因p5

3、3中，故此突變被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、機(jī)體細(xì)胞的老化和某些退行性疾病的發(fā)生都具有密切的關(guān)系。 人體細(xì)胞中，特異性切除和修復(fù)8-OHdG的酶是8-羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶(human8-oxoguanineDNAglycosylase，簡稱HOGG1)，具有切除DNA雙鏈中與堿基C配對的8-OHdG的作用，從而恢復(fù)基因組中正常的G：C配對，在維持基因組穩(wěn)定和腫瘤預(yù)防上具有舉足輕重的作用，編碼該蛋白的基因hOGG1于1997年成功克隆

4、。 人群流行病學(xué)研究顯示：hOGG1基因在不同人群存在遺傳多態(tài)性，并與癌癥易感性密切相關(guān)，其突變或缺失將增加個(gè)體罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。目前，關(guān)于hOGG1基因與環(huán)境致癌物作用的報(bào)道還不多，研究的物質(zhì)種類也很有限。此外，有關(guān)hOGG1與氧化損傷和癌癥的關(guān)系的研究結(jié)果也不盡一致，有的研究顯示外來化合物誘導(dǎo)DNA氧化損傷時(shí)，hOGG1表達(dá)下降，酶活性降低，組織中8-OHdG增加；而有的報(bào)道則相反。目前，國外正在從各個(gè)方面蓬勃開展其研究，國內(nèi)

5、的報(bào)道相對較少。本研究擬采用核酶技術(shù)和分子克隆技術(shù)建立hOGG1基因低表達(dá)的細(xì)胞株，這將為深入研究DNA氧化損傷和修復(fù)以及與癌癥的關(guān)系提供一個(gè)十分有效的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)工具。 核酶(ribozyme)技術(shù)屬于反義核酸技術(shù)之一，是繼基因克隆之后的又一全新分子生物學(xué)技術(shù)。核酶是一類具有核酸內(nèi)切酶活性、能序列特異性地剪切mRNA的RNA分子，設(shè)計(jì)合理的核酶能與被選擇的靶mRNA片段特異結(jié)合，通過多種機(jī)制抑制或封閉目的基因的mRNA表達(dá)，使其

6、失去生物學(xué)功能。由于核酶所具有的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，近10年來其研究進(jìn)展十分迅速，特別是在基因治療領(lǐng)域報(bào)道甚多，而毒理學(xué)上的應(yīng)用報(bào)道極少。 全文共分四個(gè)部分，主要研究內(nèi)容如下：第一部分：hOGG1基因特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定。應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件模擬hOGG1的二級結(jié)構(gòu)并輔助設(shè)計(jì)核酶，采用分子克隆手段將核酶基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，構(gòu)建hOGG1特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RZ，并經(jīng)

7、酶切電泳和DNA測序鑒定。 第二部分：hOGG1低表達(dá)細(xì)胞株的建立及鑒定。運(yùn)用真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法，將核酶的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RZ經(jīng)FuGENE6介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人的肺腺癌A549細(xì)胞；G418篩選，Neo基因的逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增證實(shí)轉(zhuǎn)染成功；RT-PCR半定量檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中hOGG1的表達(dá)水平，了解核酶對靶基因的抑制效果。 第三部分：hOGG1低表達(dá)細(xì)胞株的生物學(xué)特性鑒定。通過

8、觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)、生長特性、細(xì)胞周期、細(xì)胞基礎(chǔ)凋亡率、細(xì)胞增殖指數(shù)、軟瓊脂克隆形成率及超氧化物歧化酶(SOD)的活力等，了解hOGG1低表達(dá)細(xì)胞的生物學(xué)特性，為應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 第四部分：低表達(dá)細(xì)胞株在DNA氧化損傷與修復(fù)、藥物敏感性和放射敏感性研究中的初步應(yīng)用。用彗星試驗(yàn)比較重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、過氧化氫(H2O2)、抗腫瘤藥物阿霉素(ADM)和60Co-γ射線對轉(zhuǎn)染細(xì)胞(命名為A549-R細(xì)胞)和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞(即A549

9、細(xì)胞)DNA氧化損傷與修復(fù)的差異；MTT試驗(yàn)檢測兩種細(xì)胞在ADM和60Co-γ射線處理后的細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖指數(shù)的變化，以了解hOGG1的低表達(dá)對細(xì)胞的藥物敏感性和放射敏感性的影響。主要研究結(jié)果如下： 1、應(yīng)用計(jì)算機(jī)軟件模擬hOGG1的二級結(jié)構(gòu)并輔助設(shè)計(jì)了60bp的核酶基因，采用分子克隆手段將核酶基因克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上，經(jīng)酶切電泳和DNA序列測定證實(shí)核酶基因成功克隆到p

10、cDNA3.1(+)，從而構(gòu)建了hOGG1特異性錘頭狀核酶真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-RZ。 2、用FuGENE6轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA3.1(+)-RZ轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞，通過G418篩選出陽性轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆，RT-PCR擴(kuò)增Neo基因證明質(zhì)粒成功導(dǎo)入靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-RZ的A549-R細(xì)胞hOGG1的mRNA表達(dá)下降，比未轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞降低61.5％，說明核酶基因在細(xì)胞內(nèi)能夠轉(zhuǎn)錄出核酶，并

11、可有效抑制目的基因hOGG1的表達(dá)。 3、hOGG1低表達(dá)細(xì)胞株的生物學(xué)特性鑒定結(jié)果表明：在轉(zhuǎn)染初期轉(zhuǎn)染了核酶基因的A549-R細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了一定的變化，但這種變化與hOGG1無關(guān)，且隨時(shí)間的延長，兩種細(xì)胞在形態(tài)上逐漸趨于一致。兩種細(xì)胞的生長特性(群體倍增時(shí)間、進(jìn)入對數(shù)生長期時(shí)間等)、基礎(chǔ)凋亡率、細(xì)胞增殖指數(shù)和細(xì)胞周期各時(shí)相的分布均無明顯差異。軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)中轉(zhuǎn)染hOGG1核酶基因的A549-R細(xì)胞克隆形成數(shù)顯著低于未轉(zhuǎn)染的

12、A549細(xì)胞，而SOD活性則顯著高于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 4、就損傷和修復(fù)相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞和非轉(zhuǎn)染細(xì)胞在修復(fù)方面的差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于損傷的差異。對于損傷，四種受試物(K2Cr2O7、H2O2、ADM、60Co-γ射線)僅在個(gè)別濃度或個(gè)別指標(biāo)表現(xiàn)出A549-R細(xì)胞的敏感性大于A549細(xì)胞；在修復(fù)方面，無論是修復(fù)的時(shí)間或/和修復(fù)的能力均表現(xiàn)出A549-R細(xì)胞的修復(fù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于A549細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：ADM和60Co-γ射線均可引起細(xì)胞G0