轉錄因子T-bet、Eomes和IL-33對CD8+記憶和效應T細胞抗腫瘤的作用機制.pdf

1、機體的抗腫瘤免疫主要為T淋巴細胞所介導，其中CD8+細胞毒 T淋巴細胞（CTLs）及CD4+Ⅰ型輔助T細胞（Th1 cells）介導的I型適應性免疫應答是抗腫瘤免疫的基礎。T-bet和Eomes是調控CD4+Th1 cells和CD8+CTLs等I型效應T細胞分化和功能的重要轉錄因子。已有研究表明，腫瘤患者的生存期與轉錄因子T-bet和Eomes表達密切相關：腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中T-bet和Eomes表達水平高的癌癥患者生存期

2、顯著延長。最近的研究結果顯示T-bet和Eomes在由CD8+T細胞介導的抗腫瘤免疫應答中發(fā)揮重要調節(jié)作用，但其中涉及的機制，各家報道不一。免疫記憶是適應性免疫應答的重要特征之一。記憶T細胞是一具有異質性的群體，主要可以分為三個不同的亞群：效應性記憶T細胞（effector memory T cell，TEM）、中樞性記憶T細胞（central memory T cell，TCM）和干細胞樣記憶T細胞（T memory stem cel

3、ls，TSCM）。已有報道，T-bet和Eomes參與效應T細胞和記憶T細胞功能及分化的調節(jié)，但兩者對干細胞樣記憶T細胞（TSCM）的作用尚不清楚，有待進一步探討。
　　此外，既往的研究主要集中于T-bet和Eomes在淋巴器官中對T細胞的作用，然而T-bet和Eomes在炎癥組織（包括癌組織）中對CD8+T細胞分化和功能的作用及確切的機制尚未闡明。IL-1家族成員IL-33在細胞壞死過程中被釋放到組織微環(huán)境中，發(fā)揮危險信號的作用

4、從而促進炎癥反應。本課題小組前期研究發(fā)現，T-bet和Eomes參與調控CD8+T細胞表面IL-33受體ST2的表達。鑒此推測，T-bet和Eomes通過調控IL-33／ST2信號轉導增強CD8+效應T細胞在炎癥組織中的功能。針對上述未解決的科學問題，本論文開展了以下研究：
　　第一部分，T-bet和Eomes對CD8+記憶T細胞亞群形成及其抗腫瘤作用的調控
　　【目的】研究過繼性移植后，轉錄因子T-bet和Eomes對受者

5、體內記憶T細胞亞群形成以及記憶T細胞抗腫瘤效應的調控作用。
　　【方法】自B6-LY5.2/Cr小鼠皮內接種3×105 B16F0黑色素瘤細胞，移植6天后小鼠接受非致死劑量輻照，24小時后移植5×105經Th1條件下誘導培養(yǎng)3天的WT, T-bet?/?(TKO), Eomes?/?(EKO)或者T-bet/Eomes doubly deficient（DKO） pmel-1-T細胞，建立過繼性移植荷瘤動物模型，隔日測量并記錄腫瘤

6、生長情況。為分析過繼性移植T細胞在預防腫瘤生成中的作用，B6-LY5.2/Cr小鼠接受非致死劑量輻照，24小時后移植4×106經Th1條件下培養(yǎng)4天的WT, T-bet?/?, Eomes?/?或者T-bet/Eomes DKO pmel-1-T細胞，1個月后各組小鼠均皮內注射2×105 B16F0黑色素瘤細胞，隔日測量記錄腫瘤生長情況。自各組小鼠的脾臟、淋巴結以及實體瘤組織中分離獲得單細胞懸液，并通過流式細胞檢測技術檢測細胞上 CD4

7、4， CD62L等表面分子以及IFN-γ和IL-17等胞漿內細胞因子的表達水平，進一步分析T-bet和Eomes在CD8+記憶T細胞各亞群形成中的作用以及T-bet和Eomes對記憶T細胞抗腫瘤效應的作用。
　　【結果】（1）移植了WT, TKO或者EKO pmel-1-T細胞的小鼠腫瘤生長得到抑制，然而DKO pmel-1-T細胞無法抑制腫瘤的生長；（2）荷瘤小鼠接受移植20天后，在淋巴結中，與WT pmel-1-T細胞相比，T

8、KO pmel-1-T細胞占淋巴細胞的比例顯著上調，而在腫瘤浸潤的淋巴細胞中，TKO、EKO和DKO pmel-1-T細胞所占比例均顯著下降，這其中 DKO pmel-1-T細胞下降最為顯著。在脾臟中，與WT-T細胞相比，IFN-γ陽性的EKO pmel-1-T細胞比例下降，IFN-γ陽性的TKO和DKO pmel-1-T細胞比例顯著下降。這其中DKO pmel-1-T細胞下降最為顯著；（3）在過繼性移植30天后，與WT、TKO和EKO

9、基因型pmel-1-T細胞相比， DKO pmel-1-T細胞中CD44low記憶T細胞的比例顯著上調，且這群細胞表型特征為CD44lowCD62LhighSca-1+，與干細胞樣記憶T細胞特征一致；（4）在過繼性移植T細胞預防腫瘤生長實驗中，本研究發(fā)現WT, TKO和EKO pmel-1記憶T細胞可以抑制腫瘤細胞生長，但DKO記憶T細胞則無類似作用；（5）WT, TKO, EKO以及DKO四種不同基因型的pmel-1記憶T細胞在腫瘤抗

10、原再次激發(fā)后，增殖能力不存在差異，提示T-bet和Eomes可能參與調控記憶T細胞的功能，而對其增殖能力沒有直接影響。
　　【結論】本研究發(fā)現小鼠過繼性抗腫瘤免疫治療依賴于轉錄因子 T-bet和Eomes，證實轉錄因子T-bet和Eomes對于效應性和中樞性記憶T細胞具有重要作用。此外，發(fā)現同時敲除T-bet和Eomes可以促使一群CD8+干細胞樣記憶T細胞群體產生，表明T-bet和Eomes在調控效應／中樞性記憶T細胞與干細胞樣

11、記憶T細胞之間的平衡中發(fā)揮協(xié)同作用。
　　第二部分，IL-33/ST2途徑在T-bet調控下協(xié)同IL-12信號促進CD8+T細胞功能的作用和機制
　　【目的】分析 T-bet/Eomes對 CD8+T細胞中 ST2表達的調控作用，并探討IL-33/ST2信號對CD8+T細胞效應功能的作用及可能機制。
　　【方法】從C57BL/6 WT, Tbet?/?, Eomes?/?, T-bet/Eomes DKO小鼠的脾臟和淋

12、巴結中分離獲得單細胞懸液。通過流式分選或者磁珠分選獲得CD62L+CD44?CD8+初始（Na?ve）T細胞，經anti-CD3以及anti-CD28抗體包板刺激細胞，或以去除T細胞并接受輻照的脾臟細胞作為抗原提呈細胞，聯(lián)合anti-CD3抗體刺激，在Tc0、Tc1、Tc2和Tc17條件下，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。CD8+pmel-1-T細胞則經1μM gp10025-33聯(lián)合抗原提呈細胞刺激，分別在Tc0、Tc1、T

13、c2和Tc17條件下培養(yǎng)4天。收獲各亞型CD8+T細胞通過流式細胞儀以及Real-Time PCR儀檢測CD8+效應T細胞上ST2的表達，分析T-bet／Eomes在ST2表達中的作用。利用體外實驗進一步分析IL-33協(xié)同IL-12以及anti-CD3抗體對Tc1細胞生物學功能的影響及相關作用機制。
　　【結果】（1）Tc1條件下培養(yǎng)的CD8+T細胞上ST2 mRNA高表達。與其它極化培養(yǎng)條件下的細胞相比，而Tc2條件下培養(yǎng)的CD

14、8+T細胞上ST2 mRNA的表達水平最低，TCR信號可以進一步增強Tc1細胞上ST2的mRNA水平;（2）Tc1細胞上ST2的表達主要依賴于轉錄因子T-bet，但轉錄因子Eomes似乎不參與調控細胞上ST2的mRNA水平;（3）IL-33在TCR和（或）IL-12信號協(xié)同作用下可顯著促進Tc1細胞分泌IFN-γ，而上述協(xié)同作用依賴于T-bet;（4）IL-33協(xié)同IL-12可以顯著上調Tc1細胞上IFN-γ，T-bet以及Blimp1

15、的mRNA水平，下調TCF-1和LEF-1的mRNA水平;（5）敲除Gadd45b基因可以下調Tc1細胞中p38蛋白磷酸化水平以及IL-12協(xié)同IL-33誘導的IFN-γmRNA水平。而p38抑制劑幾乎可以完全抑制IL-12協(xié)同IL-33對IFN-γ表達的作用。
　　【結論】本研究發(fā)現Tc1效應T細胞上高表達IL-33的受體ST2，并受T-bet調控。證實IL-33/ST2途徑協(xié)同IL-12信號以Gadd45/p38依賴機制，促進