轉(zhuǎn)錄因子T-bet、Eomes和IL-33對(duì)CD8+記憶和效應(yīng)T細(xì)胞抗腫瘤的作用機(jī)制.pdf

1、機(jī)體的抗腫瘤免疫主要為T(mén)淋巴細(xì)胞所介導(dǎo)，其中CD8+細(xì)胞毒 T淋巴細(xì)胞（CTLs）及CD4+Ⅰ型輔助T細(xì)胞（Th1 cells）介導(dǎo)的I型適應(yīng)性免疫應(yīng)答是抗腫瘤免疫的基礎(chǔ)。T-bet和Eomes是調(diào)控CD4+Th1 cells和CD8+CTLs等I型效應(yīng)T細(xì)胞分化和功能的重要轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明，腫瘤患者的生存期與轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes表達(dá)密切相關(guān)：腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）中T-bet和Eomes表達(dá)水平高的癌癥患者生存期

2、顯著延長(zhǎng)。最近的研究結(jié)果顯示T-bet和Eomes在由CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，但其中涉及的機(jī)制，各家報(bào)道不一。免疫記憶是適應(yīng)性免疫應(yīng)答的重要特征之一。記憶T細(xì)胞是一具有異質(zhì)性的群體，主要可以分為三個(gè)不同的亞群：效應(yīng)性記憶T細(xì)胞（effector memory T cell，TEM）、中樞性記憶T細(xì)胞（central memory T cell，TCM）和干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞（T memory stem cel

3、ls，TSCM）。已有報(bào)道，T-bet和Eomes參與效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞功能及分化的調(diào)節(jié)，但兩者對(duì)干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞（TSCM）的作用尚不清楚，有待進(jìn)一步探討。
　　此外，既往的研究主要集中于T-bet和Eomes在淋巴器官中對(duì)T細(xì)胞的作用，然而T-bet和Eomes在炎癥組織（包括癌組織）中對(duì)CD8+T細(xì)胞分化和功能的作用及確切的機(jī)制尚未闡明。IL-1家族成員IL-33在細(xì)胞壞死過(guò)程中被釋放到組織微環(huán)境中，發(fā)揮危險(xiǎn)信號(hào)的作用

4、從而促進(jìn)炎癥反應(yīng)。本課題小組前期研究發(fā)現(xiàn)，T-bet和Eomes參與調(diào)控CD8+T細(xì)胞表面IL-33受體ST2的表達(dá)。鑒此推測(cè)，T-bet和Eomes通過(guò)調(diào)控IL-33／ST2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)增強(qiáng)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞在炎癥組織中的功能。針對(duì)上述未解決的科學(xué)問(wèn)題，本論文開(kāi)展了以下研究：
　　第一部分，T-bet和Eomes對(duì)CD8+記憶T細(xì)胞亞群形成及其抗腫瘤作用的調(diào)控
　　【目的】研究過(guò)繼性移植后，轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes對(duì)受者

5、體內(nèi)記憶T細(xì)胞亞群形成以及記憶T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的調(diào)控作用。
　　【方法】自B6-LY5.2/Cr小鼠皮內(nèi)接種3×105 B16F0黑色素瘤細(xì)胞，移植6天后小鼠接受非致死劑量輻照，24小時(shí)后移植5×105經(jīng)Th1條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)3天的WT, T-bet?/?(TKO), Eomes?/?(EKO)或者T-bet/Eomes doubly deficient（DKO） pmel-1-T細(xì)胞，建立過(guò)繼性移植荷瘤動(dòng)物模型，隔日測(cè)量并記錄腫瘤

6、生長(zhǎng)情況。為分析過(guò)繼性移植T細(xì)胞在預(yù)防腫瘤生成中的作用，B6-LY5.2/Cr小鼠接受非致死劑量輻照，24小時(shí)后移植4×106經(jīng)Th1條件下培養(yǎng)4天的WT, T-bet?/?, Eomes?/?或者T-bet/Eomes DKO pmel-1-T細(xì)胞，1個(gè)月后各組小鼠均皮內(nèi)注射2×105 B16F0黑色素瘤細(xì)胞，隔日測(cè)量記錄腫瘤生長(zhǎng)情況。自各組小鼠的脾臟、淋巴結(jié)以及實(shí)體瘤組織中分離獲得單細(xì)胞懸液，并通過(guò)流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞上 CD4

7、4， CD62L等表面分子以及IFN-γ和IL-17等胞漿內(nèi)細(xì)胞因子的表達(dá)水平，進(jìn)一步分析T-bet和Eomes在CD8+記憶T細(xì)胞各亞群形成中的作用以及T-bet和Eomes對(duì)記憶T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的作用。
　　【結(jié)果】（1）移植了WT, TKO或者EKO pmel-1-T細(xì)胞的小鼠腫瘤生長(zhǎng)得到抑制，然而DKO pmel-1-T細(xì)胞無(wú)法抑制腫瘤的生長(zhǎng)；（2）荷瘤小鼠接受移植20天后，在淋巴結(jié)中，與WT pmel-1-T細(xì)胞相比，T

8、KO pmel-1-T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞的比例顯著上調(diào)，而在腫瘤浸潤(rùn)的淋巴細(xì)胞中，TKO、EKO和DKO pmel-1-T細(xì)胞所占比例均顯著下降，這其中 DKO pmel-1-T細(xì)胞下降最為顯著。在脾臟中，與WT-T細(xì)胞相比，IFN-γ陽(yáng)性的EKO pmel-1-T細(xì)胞比例下降，IFN-γ陽(yáng)性的TKO和DKO pmel-1-T細(xì)胞比例顯著下降。這其中DKO pmel-1-T細(xì)胞下降最為顯著；（3）在過(guò)繼性移植30天后，與WT、TKO和EKO

9、基因型pmel-1-T細(xì)胞相比， DKO pmel-1-T細(xì)胞中CD44low記憶T細(xì)胞的比例顯著上調(diào)，且這群細(xì)胞表型特征為CD44lowCD62LhighSca-1+，與干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞特征一致；（4）在過(guò)繼性移植T細(xì)胞預(yù)防腫瘤生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)WT, TKO和EKO pmel-1記憶T細(xì)胞可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但DKO記憶T細(xì)胞則無(wú)類(lèi)似作用；（5）WT, TKO, EKO以及DKO四種不同基因型的pmel-1記憶T細(xì)胞在腫瘤抗

10、原再次激發(fā)后，增殖能力不存在差異，提示T-bet和Eomes可能參與調(diào)控記憶T細(xì)胞的功能，而對(duì)其增殖能力沒(méi)有直接影響。
　　【結(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)小鼠過(guò)繼性抗腫瘤免疫治療依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子 T-bet和Eomes，證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子T-bet和Eomes對(duì)于效應(yīng)性和中樞性記憶T細(xì)胞具有重要作用。此外，發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲除T-bet和Eomes可以促使一群CD8+干細(xì)胞樣記憶T細(xì)胞群體產(chǎn)生，表明T-bet和Eomes在調(diào)控效應(yīng)／中樞性記憶T細(xì)胞與干細(xì)胞樣

11、記憶T細(xì)胞之間的平衡中發(fā)揮協(xié)同作用。
　　第二部分，IL-33/ST2途徑在T-bet調(diào)控下協(xié)同IL-12信號(hào)促進(jìn)CD8+T細(xì)胞功能的作用和機(jī)制
　　【目的】分析 T-bet/Eomes對(duì) CD8+T細(xì)胞中 ST2表達(dá)的調(diào)控作用，并探討IL-33/ST2信號(hào)對(duì)CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能的作用及可能機(jī)制。
　　【方法】從C57BL/6 WT, Tbet?/?, Eomes?/?, T-bet/Eomes DKO小鼠的脾臟和淋

12、巴結(jié)中分離獲得單細(xì)胞懸液。通過(guò)流式分選或者磁珠分選獲得CD62L+CD44?CD8+初始（Na?ve）T細(xì)胞，經(jīng)anti-CD3以及anti-CD28抗體包板刺激細(xì)胞，或以去除T細(xì)胞并接受輻照的脾臟細(xì)胞作為抗原提呈細(xì)胞，聯(lián)合anti-CD3抗體刺激，在Tc0、Tc1、Tc2和Tc17條件下，使用RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。CD8+pmel-1-T細(xì)胞則經(jīng)1μM gp10025-33聯(lián)合抗原提呈細(xì)胞刺激，分別在Tc0、Tc1、T

13、c2和Tc17條件下培養(yǎng)4天。收獲各亞型CD8+T細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀以及Real-Time PCR儀檢測(cè)CD8+效應(yīng)T細(xì)胞上ST2的表達(dá)，分析T-bet／Eomes在ST2表達(dá)中的作用。利用體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析IL-33協(xié)同IL-12以及anti-CD3抗體對(duì)Tc1細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及相關(guān)作用機(jī)制。
　　【結(jié)果】（1）Tc1條件下培養(yǎng)的CD8+T細(xì)胞上ST2 mRNA高表達(dá)。與其它極化培養(yǎng)條件下的細(xì)胞相比，而Tc2條件下培養(yǎng)的CD

14、8+T細(xì)胞上ST2 mRNA的表達(dá)水平最低，TCR信號(hào)可以進(jìn)一步增強(qiáng)Tc1細(xì)胞上ST2的mRNA水平;（2）Tc1細(xì)胞上ST2的表達(dá)主要依賴(lài)于轉(zhuǎn)錄因子T-bet，但轉(zhuǎn)錄因子Eomes似乎不參與調(diào)控細(xì)胞上ST2的mRNA水平;（3）IL-33在TCR和（或）IL-12信號(hào)協(xié)同作用下可顯著促進(jìn)Tc1細(xì)胞分泌IFN-γ，而上述協(xié)同作用依賴(lài)于T-bet;（4）IL-33協(xié)同IL-12可以顯著上調(diào)Tc1細(xì)胞上IFN-γ，T-bet以及Blimp1

15、的mRNA水平，下調(diào)TCF-1和LEF-1的mRNA水平;（5）敲除Gadd45b基因可以下調(diào)Tc1細(xì)胞中p38蛋白磷酸化水平以及IL-12協(xié)同IL-33誘導(dǎo)的IFN-γmRNA水平。而p38抑制劑幾乎可以完全抑制IL-12協(xié)同IL-33對(duì)IFN-γ表達(dá)的作用。
　　【結(jié)論】本研究發(fā)現(xiàn)Tc1效應(yīng)T細(xì)胞上高表達(dá)IL-33的受體ST2，并受T-bet調(diào)控。證實(shí)IL-33/ST2途徑協(xié)同IL-12信號(hào)以Gadd45/p38依賴(lài)機(jī)制，促進(jìn)