莪術(shù)油注射液致人卵巢癌SKOV3細胞脹亡及作用機制研究.pdf

1、目的：探討莪術(shù)油注射液對體外培養(yǎng)人卵巢癌SKOV3細胞的生長抑制作用，從細胞脹亡角度來考察細胞生長抑制的機制，并初步研究莪術(shù)油注射液誘導(dǎo)SKOV3細胞發(fā)生脹亡的分子機制。
　　方法：本實驗以不同的藥物濃度作用人卵巢癌SKOV3細胞株后，采用MTT法檢測莪術(shù)油注射液對 SKOV3細胞的抑制增殖作用；通過倒臵顯微鏡觀察細胞在培養(yǎng)液中的形態(tài)學變化；以熒光顯微鏡觀察 AO染色后細胞核的形態(tài)變化；對細胞進行HE染色后通過光學顯微鏡觀察細胞形

2、態(tài)學變化；通過透射電鏡觀察細胞的超微結(jié)構(gòu)變化和計數(shù)脹亡指數(shù)；通過DNA凝膠電泳觀察細胞DNA斷裂的特征；通過免疫組化法檢測細胞bcl-2基因表達水平；通過全自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)液上清液乳酸脫氫酶（LDH）水平；熒光染料2',7'-二氯熒光素乙二酯、10-壬基吖啶橙結(jié)合熒光化學發(fā)光儀分別檢測細胞內(nèi)活性氧（ROS）及線粒體心磷脂（MTCL）水平。
　　結(jié)果：①莪術(shù)油注射液對SKOV3細胞體外生長具有明顯的抑制作用，其抑制作用隨濃

3、度的增加而不斷加強，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，其中48h半數(shù)抑制濃度（IC50）為55.16ug/ml；②選擇31.25、62.5、125μg/ml濃度的莪術(shù)油作用細胞48h后倒臵顯微鏡觀察，大體可見細胞密度明顯減少，胞體變長,細胞內(nèi)顆粒感增強，細胞界限模糊,細胞間隙逐漸增寬，細胞質(zhì)減少,胞漿減少,細胞脫落呈懸浮狀,存活細胞減少，細胞核碎裂，可見細胞碎片，隨著莪術(shù)油作用濃度的增加，上述現(xiàn)象更加明顯；③選擇31.25、62.5、125μg/ml

4、濃度的莪術(shù)油作用細胞48h后熒光顯微鏡觀察，主要變化為細胞腫脹，體積增大，胞膜面積縮小，核染色質(zhì)分散擴大；④選擇31.25、62.5、125μg/ml濃度的莪術(shù)油作用細胞48h后HE染色普通光鏡觀察，主要變化為細胞腫脹，體積增大，胞漿空泡化，胞漿內(nèi)出現(xiàn)致密顆粒，胞質(zhì)空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹；細胞核內(nèi)染色質(zhì)分散，凝集在核膜、核仁周圍，有時聚集成團塊；胞膜起泡，通透性增加，細胞膜完整性破壞、胞膜崩解，最后細胞核溶解；⑤選擇31.25、62.5、1

5、25μg/ml濃度的莪術(shù)油作用細胞48h后透射電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)卵巢癌細胞胞體腫脹，細胞膜空泡化，細胞質(zhì)出現(xiàn)蟲蝕狀和空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，線粒體腫脹，嵴破壞，數(shù)量減少，細胞核染色質(zhì)分散，凝集在核膜、核仁周圍，甚至核膜完整性破壞，結(jié)構(gòu)崩解，核溶解性，細胞內(nèi)容物逸出的典型脹亡細胞形態(tài)。其細胞脹亡指數(shù)(OI)隨濃度的增加而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；⑥選擇31.25、55.16、62.5、125μg/ml濃度的莪術(shù)油作用細胞48h后瓊脂糖電泳結(jié)果

6、，SKOV3細胞DNA條帶均呈彌漫型；⑦免疫組化結(jié)果表明：各莪術(shù)油注射液組細胞中Bcl-2蛋白免疫組化染色綜合得分與空白組比較下降，提示莪術(shù)油注射液具有下調(diào)Bcl-2蛋白表達的作用；⑧全自動生化分析儀檢測結(jié)果表明：與空白組比較，各莪術(shù)油注射液組細胞培養(yǎng)液上清液乳酸脫氫酶數(shù)值均升高，并且隨莪術(shù)油注射液劑量的增加而升高，提示莪術(shù)油注射液能使LDH從SKOV3細胞中漏出；⑨熒光化學發(fā)光儀檢測結(jié)果表明：各莪術(shù)油注射液組SKOV3細胞內(nèi)ROS的數(shù)

7、值均增加，并且隨莪術(shù)油注射液劑量的增大而增加，提示莪術(shù)油注射液具有增加細胞內(nèi)ROS含量的作用；各莪術(shù)油注射液組SKOV3細胞內(nèi)MTCL數(shù)值與空白組比較均下降，并且隨莪術(shù)油注射液劑量的增加逐漸下降，提示莪術(shù)油注射液具有降低細胞內(nèi)MTCL含量的作用。
　　結(jié)論：①莪術(shù)油注射液對 SKOV3細胞體外生長具有明顯的抑制作用，抑制作用呈量效關(guān)系，其中48h半數(shù)抑制濃度（IC50）為55.16ug/ml；②莪術(shù)油注射液可使培養(yǎng)液中的SKOV3

8、細胞出現(xiàn)細胞裂解現(xiàn)象，并隨著莪術(shù)油注射液作用濃度的增加更加明顯；③莪術(shù)油注射液導(dǎo)致SKOV3細胞出現(xiàn)細胞脹亡，脹亡指數(shù)有劑量依賴性；④莪術(shù)油注射液能下調(diào)Bcl-2蛋白表達；⑤莪術(shù)油注射液能促進LDH從SKOV3細胞中漏出，漏出量有劑量依賴性；⑥莪術(shù)油注射液能增加細胞內(nèi)ROS含量，含量有劑量依賴性；⑦莪術(shù)油注射液能降低細胞內(nèi)MTCL含量，含量有劑量依賴性。總之，莪術(shù)油注射液能導(dǎo)致體外培養(yǎng)的SKOV3細胞脹亡，并能下調(diào)細胞Bcl-2蛋白表達