抗腫瘤新藥德氮吡格的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、癌癥對人類的威脅日益嚴重，而人們在攻克癌癥的征途中，卻舉步維艱。目前用于臨床的抗腫瘤藥物存在的主要問題是：選擇性差，對實體瘤作用不佳，易產(chǎn)生多藥耐藥性等。 本課題研究的德氮吡格(Tetrazanbigen，TNBG)是自主創(chuàng)新設(shè)計合成的氮雜甾烷類化合物。經(jīng)體內(nèi)、外實驗證明，德氮吡格具有良好的抗腫瘤作用，能顯著延長荷瘤動物的生存期，且無交叉耐藥性。在德氮吡格對人肝癌細胞QGY-7701的實驗中，觀察到德氮吡格引起腫瘤細胞內(nèi)大量脂滴

2、聚積的特殊現(xiàn)象；基因芯片篩選出的眾多差異基因中以脂代謝相關(guān)基因變化最顯著。由此，我們提出德氮吡格可能通過影響腫瘤細胞的脂代謝達到抗腫瘤的目的，但其分子作用機制有待進一步研究。 本文擬采用蛋白質(zhì)組學方法，比較德氮吡格給藥前后人肝癌細胞QGY-7701的蛋白質(zhì)差異，探索德氮吡格影響腫瘤細胞脂代謝產(chǎn)生脂質(zhì)聚積的特殊現(xiàn)象，以及抗腫瘤作用的機制，望能找到德氮吡格作用的靶點，為抗腫瘤藥物研發(fā)提供新思路。 本文完成的主要工作和結(jié)論如下

3、： 1、建立了人肝癌細胞QGY-7701的細胞漿、細胞膜、細胞核蛋白質(zhì)組雙向電泳分離技術(shù)。采用亞細胞抽提試劑盒提取各亞細胞組分，以不同的方法除鹽濃縮蛋白質(zhì)樣品，然后，分別采用兩種不同的水化上樣緩沖液重懸樣品，進行雙向凝膠電泳。結(jié)果顯示：聯(lián)合使用丙酮、三氯乙酸的除鹽效果好，樣品損失少；采用上樣緩沖液Ⅱ(7mol/L尿素+2mol/L硫脲+4％CHAPS+40mmol/L Tris+65mmol/L DTT+2％兩性電解質(zhì))有利于蛋

4、白的溶解，獲得更多的蛋白信息，檢出的細胞漿蛋白點可達995±53，細胞膜蛋白點可達1035±58，細胞核蛋白點可達893±45。 2、利用上述建立的雙向電泳技術(shù)，分離德氮吡格(4μg/mL)給藥前后的人肝癌細胞QGY-7701的細胞漿、細胞膜、細胞核蛋白，用PDQuest(7.4.0)軟件進行比較分析、尋找二倍以上的差異表達蛋白。結(jié)果顯示：德氮吡格作用于人肝癌細胞QGY-7701 72h后，細胞漿的差異表達蛋白點有56個，細胞膜

5、的差異表達蛋白點有65個，細胞核的差異表達蛋白點有34個，共計差異表達蛋白點有155個。 3、結(jié)合基因芯片，從155個差異表達蛋白點中篩選出14個細胞漿蛋白點、25個細胞膜蛋白點、9個細胞核蛋白點進行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，MS-Fit數(shù)據(jù)庫鑒定。 結(jié)果鑒定出33個差異表達蛋白，其中包括與脂質(zhì)合成有關(guān)的11個蛋白，與脂質(zhì)降解有關(guān)的4個蛋白和與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運有關(guān)的3個蛋白。在這些差異蛋白中與脂代謝有關(guān)的蛋白變化最明顯，

6、蛋白質(zhì)組學研究結(jié)果與基因芯片研究結(jié)果一致。 4、采用Western blot方法，對變化顯著的脂代謝信號轉(zhuǎn)導通路的上游調(diào)控因子SREBP-1和脂質(zhì)轉(zhuǎn)出途徑關(guān)鍵蛋白MTTP進行研究。 實驗結(jié)果顯示：4gg/mL德氮吡格作用于人肝癌細胞QGY-7701 72h后，SREBP-1的表達增加，MTTP的表達降低，蛋白水平的驗證結(jié)果與比較蛋白質(zhì)組學的分析結(jié)果一致。從蛋白質(zhì)水平上，這進一步支持德氮吡格抗腫瘤作用的主要機制是通過干擾腫

7、瘤細胞的脂代謝。 5、通過上述差異蛋白的功能分析可知，德氮吡格對腫瘤細胞脂代謝調(diào)控所導致腫瘤細胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚積可能通過以下幾條途徑： ①SREBP-2調(diào)控的膽固醇合成增加途徑； ②SREBP-1調(diào)控的甘油三酯合成增加途徑； ③脂質(zhì)分解途徑被抑制； ④MTTP調(diào)控的脂質(zhì)轉(zhuǎn)出途徑被抑制。 由此可知，德氮吡格除通過SREBPs途徑增加膽固醇和甘油三酯合成外，導致腫瘤細胞內(nèi)脂質(zhì)大量聚積主要原因可能