硬脂酰魚(yú)精蛋白的合成及用作非病毒基因載體的研究.pdf

1、本文研究了硬脂酰魚(yú)精蛋白的合成，并將其作為非病毒基因載體，考察了與質(zhì)粒DNA的復(fù)合性能，復(fù)合物的體外基因轉(zhuǎn)染效果。主要內(nèi)容包括以下三部分： 1）通過(guò)N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）與硬脂酸形成的活潑酯，在水性反應(yīng)環(huán)境中與魚(yú)精蛋白進(jìn)行酯交換反應(yīng)，從而將疏水性的硬脂?；鶊F(tuán)偶聯(lián)到魚(yú)精蛋白上，成功合成了三種硬脂酰魚(yú)精蛋白（stearyl protamine，簡(jiǎn)稱SP），分別為SP1，SP2，SP3。將SP在HCl中降解后回收硬脂酸，并用酸堿

2、微量滴定的方法測(cè)定含量。SP中硬脂?；鶊F(tuán)的含量（質(zhì)量百分比）分別為2.5％、3.0％、5.5％。通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射（DLS）對(duì)SP以及硫酸魚(yú)精蛋白（PS）的研究發(fā)現(xiàn)，SP3可以在水中自組裝形粒徑110nm左右的穩(wěn)定聚集體，此聚集體的粒徑不隨SP3濃度的提高而發(fā)生變化，說(shuō)明是一種熱力學(xué)穩(wěn)定的自組裝聚集體。 2）通過(guò)工程菌擴(kuò)增，堿法抽提，獲得編碼螢火蟲(chóng)熒光素酶的質(zhì)粒DNA pGL3-control，并以此作為后繼實(shí)驗(yàn)中采用的DNA材料。

3、凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)SP對(duì)DNA的復(fù)合能力，結(jié)果表明當(dāng)載體/DNA質(zhì)量比超過(guò)1.0時(shí)，DNA均能被三種SP完全包裝起來(lái)。與未修飾的魚(yú)精蛋白相比，隨著SP中硬脂?；鶊F(tuán)含量的升高，其對(duì)DNA的復(fù)合能力略有減弱。對(duì)魚(yú)精蛋白、三種SP的水溶液以及不同載體/DNA質(zhì)量比條件下的載體/DNA復(fù)合物進(jìn)行了粒徑測(cè)定。結(jié)果表明，載體/DNA比例大于1.0時(shí)，可形成粒徑較小的復(fù)合物。在所有實(shí)驗(yàn)中載體/DNA比例下，復(fù)合物粒徑都小于150nm。SP1、SP2

4、與DNA的復(fù)合物在各個(gè)比例下，粒徑都接近未修飾的硫酸魚(yú)精蛋白與DNA的復(fù)合物，而SP3與DNA的復(fù)合物粒徑顯著高于其余三者，由于SP3本身可以在水中自組裝形成穩(wěn)定的納米顆粒。這表明SP3與DNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)不同于其余三者。在Dnase I防護(hù)實(shí)驗(yàn)中， SP/DNA復(fù)合物都能有效保護(hù)DNA不受Dnase I的破壞。 3）以H1299人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為對(duì)象，評(píng)估了SP的細(xì)胞毒性和t體外轉(zhuǎn)染效果。MTT實(shí)驗(yàn)表明，在2.5μg/ml