透明質(zhì)酸包封的非病毒基因微載體的研究.pdf

1、采用超分子組裝技術(shù)制備的非病毒基因傳遞體系，由于具有合適的納米尺寸、可控的結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景。制備具有良好生物穩(wěn)定性、低細(xì)胞毒性并高效轉(zhuǎn)染的非病毒基因微載體是亟需解決的關(guān)鍵的科學(xué)問題之一。聚乙烯亞胺(PEI)由于具有“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，是常用的一類非病毒基因載體。但PEI/DNA組裝體在體內(nèi)易聚集，從而被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除出體內(nèi)，限制了治療基因到達(dá)靶向細(xì)胞、組織的數(shù)量。透明質(zhì)酸(HA)是一種帶有負(fù)電荷的天

2、然多糖，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，具有優(yōu)異的生物相容性。本文以透明質(zhì)酸或巰基化透明質(zhì)酸為被膜材料，采用超分子組裝技術(shù)制備了三元締合的基因超分子組裝體，初步探討了超分子組裝體的結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)在聯(lián)系。主要研究內(nèi)容包括：
　　 ⑴將透明質(zhì)酸加入到PEI/DNA組裝體溶液中，在靜電驅(qū)動(dòng)力作用下，形成PEI/DNA/HA超分子組裝體。HA的加入量對(duì)組裝體的性質(zhì)有很大的影響。隨著HA加入量的增大，PEI/DNA/HA組裝體的表面電位逐

3、漸降低。原子力顯微鏡及透射電鏡圖片顯示：PEI/DNA/HA組裝體呈現(xiàn)規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，尺寸為250nm左右。凝膠電泳及熒光光譜測(cè)定結(jié)果表明：HA的加入使得熒光強(qiáng)度略有增強(qiáng)，組裝體結(jié)合松散，但并沒有觀察到自由的DNA條帶，說明HA的加入并沒有導(dǎo)致基因超分子組裝體的解離。體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：與PEI/DNA組裝體相比，PEI/DNA/HA組裝體的細(xì)胞毒性顯著降低。不同細(xì)胞對(duì)HA包封基因微載體的內(nèi)吞及轉(zhuǎn)染效率顯示出差異。由于細(xì)胞膜表面為負(fù)電

4、，隨著HA的加入，帶負(fù)電荷的HA包封基因微載體不易被HEK293T細(xì)胞內(nèi)吞，轉(zhuǎn)染效率略有降低。與此相對(duì)，肝腫瘤細(xì)胞HepG2細(xì)胞對(duì)PEI/DNA/HA組裝體的內(nèi)吞率較PEI/DNA組裝體有了明顯提高，轉(zhuǎn)染效率也隨之大幅度增加。我們認(rèn)為由于腫瘤細(xì)胞表面存在大量HA的受體CD44，可通過HA的受體介導(dǎo)內(nèi)吞提高基因超分子組裝體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞率及轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞的效率。
　　 ⑵合成了巰基化透明質(zhì)酸(HA-SH),并以此為被膜制備了PE

5、I/DNA/HA-SH組裝體，通過巰基在氧氣中的原位交聯(lián)，制備了殼層二硫鍵原位交聯(lián)的基因超分子組裝體。動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果及透射電鏡圖像表明；隨著殼層的交聯(lián)，基因微載體為粒徑在200nm左右的球狀結(jié)構(gòu)。與PEI/DNA/HA組裝體相比，殼層的原位交聯(lián)使微載體對(duì)DNA的締合更緊密，同時(shí)在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性有所提高。以聚丙烯酸(PAA)為模型聚陰離子，凝膠電泳測(cè)定結(jié)果表明：當(dāng)PAA濃度為2mmol/L時(shí)，PEI/DNA/HA組裝體完全解離，釋放

6、出自由的DNA;而隨著氧氣中交聯(lián)時(shí)間的延長，殼層原位交聯(lián)的組裝體的聚陰離子穩(wěn)定性顯著提高。殼層原位交聯(lián)組裝體還顯示出谷胱甘肽響應(yīng)特性，在谷胱甘肽濃度達(dá)到3mmol/L時(shí)，由于二硫鍵的斷裂導(dǎo)致交聯(lián)殼層的消失，在負(fù)電荷的PAA的作用下，組裝體解離釋放出自由DNA。HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示：巰基化透明質(zhì)酸包封的基因微載體的細(xì)胞毒性明顯降低。由于HEK293T細(xì)胞膜表面帶負(fù)電，殼層原位交聯(lián)的組裝體的內(nèi)吞率較PEI/DNA組裝體低，轉(zhuǎn)染效率