超分子組裝非病毒基因載體及其仿生特性的研究.pdf

1、現(xiàn)代基因技術(shù)和人類基因組工程圖譜的完成為采用基因分子生物學(xué)方法治療各類疾病,提高人類生命質(zhì)量提供了廣闊的前景.基因治療的研究已經(jīng)深入醫(yī)學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域,成為當(dāng)今最活躍的生物高技術(shù)領(lǐng)域之一.采用超分子組裝技術(shù)制備的非病毒基因傳遞體系,由于具有合適的納米尺寸、可控的結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性,顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿皯?yīng)用前景.如何提高非病毒基因載體在體內(nèi)的穩(wěn)定傳遞和高效轉(zhuǎn)染是這類傳遞體系所需解決的關(guān)鍵的科學(xué)問(wèn)題.病毒是由蛋白質(zhì)殼層所包被的具有核殼

2、結(jié)構(gòu)的天然超分子組裝體,其細(xì)胞外穩(wěn)定存在、細(xì)胞內(nèi)解組裝響應(yīng)并高效轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)為非病毒基因傳遞體系的設(shè)計(jì)提供了很好的啟迪.本論文以構(gòu)建穩(wěn)定傳遞和高效轉(zhuǎn)染的非病毒基因傳遞體系為研究背景,采用超分子組裝技術(shù)與基因技術(shù)相結(jié)合,制備了模擬病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的非病毒基因超分子組裝體,初步探討了超分子組裝體的結(jié)構(gòu)與基因轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)在聯(lián)系. 聚乙烯亞胺(PEI)具有的"質(zhì)子海綿效應(yīng)"有利于其從溶酶體中逃離出來(lái),是目前常用的一類非病毒基因載體.但PEI/D

3、NA組裝體在生理鹽溶液中不穩(wěn)定、易聚集,制備PEG化的基因超分子組裝體可解決上述問(wèn)題.本文首先通過(guò)含PEG鏈段的兩親聚合物的自組織共混改性,采用超分子技術(shù)構(gòu)建了基于疏水作用力的新型PEG化基因超分子組裝體.膽固醇一聚乙二醇(CPEG)的加入用量及次序?qū)虺肿咏M裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性產(chǎn)生很大影響.將CPEG與PEl25k的混合溶液加入到等體積的DNA溶液中,制備的PEI<,25k>/CPEG/DNA組裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性得到

4、很大提高;而在PEI<,25k>/DNA組裝體形成之后,再加入CPEG則不能提高其穩(wěn)定性.這一現(xiàn)象顯示新型PEG化基因組裝體的形成,與疏水膽固醇參與到疏水核(由PEI<,25k>和DNA靜電中和形成)的組裝密切相關(guān).研究進(jìn)一步采用以表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pEGFP為模型,將制備的基因超分子組裝體在生理鹽溶液中放置不同的時(shí)間,并轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞.熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀結(jié)果表明:隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng),PEI<,25k>/DNA組裝體的轉(zhuǎn)

5、染效率顯著降低;而通過(guò)CPEG共混改性后的PEI<,25k>/CPEG/DNA基因組裝體由于在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性得到很大提高,合適的粒子尺寸使其在體外的基因轉(zhuǎn)染效率顯著提高.含PEG鏈段兩親分子的自組織共混為制備具有新型的PEG化基因超分子組裝體,提高其在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性及基因轉(zhuǎn)染效率,提供了簡(jiǎn)單有效的新途徑.針對(duì)基因載體與DNA分子在傳遞過(guò)程中的穩(wěn)定締合和在細(xì)胞內(nèi)的解離釋放這一對(duì)矛盾,本研究依據(jù)病毒的蛋白質(zhì)殼層細(xì)胞內(nèi)外響應(yīng)傳遞的

6、特點(diǎn),開(kāi)展了生物響應(yīng)型非病毒基因傳遞體系的研究.研究利用細(xì)胞內(nèi)高濃度谷胱甘肽對(duì)-S-S-鍵的響應(yīng)特性,由低分子量PEI<,1800>出發(fā),通過(guò)與二甲基3,3'-二硫代一雙(丙亞氨酸酯)二氯化氫(DTBP)的交聯(lián)反應(yīng),合成了一系列含-S-S-鍵的交聯(lián)聚乙烯亞胺(CLPEI),通過(guò)對(duì)交聯(lián)程度和組裝條件的調(diào)控,成功制備了谷胱甘肽響應(yīng)的CLPEI<,80﹪>/DNA基因超分子組裝體.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CLPEI<,50﹪>具有最佳的締合DNA分子的

7、能力,并在pH值為7.4到5的范圍內(nèi),依然具有足夠的質(zhì)子緩沖能力,有利于基因超分子組裝體從溶酶體中逃離出來(lái).在pH為6.0、NaCI濃度為20 mM的條件下,能與DNA形成直徑在150 nm左右的球形粒子.在模擬細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽濃度的條件下,CLPEI<,50﹪>分子中-S-S-鍵的斷裂導(dǎo)致高分子量聚陽(yáng)離子轉(zhuǎn)變?yōu)榈头肿恿科瑪?實(shí)現(xiàn)組裝體的解組裝響應(yīng).體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明:這種仿生交聯(lián)的基因組裝體可顯著降低細(xì)胞毒性,并有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞.

8、為進(jìn)一步增強(qiáng)基因超分子組裝體的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率,研究以病毒組裝過(guò)程中生物大分子交聯(lián)的"籠狀"結(jié)構(gòu)為啟示,開(kāi)展了"籠狀"仿生交聯(lián)組裝體的研究.合成了含巰基的聚乙烯亞胺(HS-PEI),與DNA組裝后,分別通過(guò)空氣中巰基的氧化交聯(lián)制備殼層原位交聯(lián)的基因超分子組裝體;通過(guò)金納米粒子(AuNP)與巰基的共價(jià)締合,制備殼層納米金交聯(lián)的組裝體.熒光光譜測(cè)定結(jié)果表明:在N/P值為10的條件下,巰基化聚乙烯亞胺(HS-PEI)能有效誘導(dǎo)DNA分子的締合

9、.在pH為6.0、NaCl濃度為20 mM的HEPEs緩沖溶液中,這種殼層交聯(lián)的組裝體的尺寸在150nm左右.對(duì)于殼層AuNP交聯(lián)的Au-S-PEI/DNA組裝體,由TEM圖片我們可清晰觀察到殼層金納米粒子的存在,且隨著AuNP加入量的增加,殼層交聯(lián)的金納米粒子含量也顯著增加.與殼層未交聯(lián)的基因超分子組裝體相比,殼層交聯(lián)的"籠狀"結(jié)構(gòu)可有效提高組裝體在生理鹽溶液中的穩(wěn)定性,并顯示出很好的谷胱甘肽響應(yīng)特性.體外細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果表明:通過(guò)選擇合

10、適的組裝條件,仿生交聯(lián)的"籠狀"非病毒基因傳遞體系可有效轉(zhuǎn)染. 采用超分子組裝技術(shù)構(gòu)建仿病毒基因傳遞體系,使其既具備非病毒載體的低毒性、低免疫原性的特點(diǎn),又具有病毒載體高效轉(zhuǎn)染的特性,將是未來(lái)基因傳遞體系的發(fā)展方向.本論文采用超分子組裝手段,通過(guò)含PEG鏈段兩親聚合物的自組織共混改性,制備了新型PEG化基因超分子組裝體;利用谷胱甘肽的生物開(kāi)關(guān)效應(yīng),設(shè)計(jì)了含二硫鍵的聚陽(yáng)離子,制備了細(xì)胞內(nèi)外響應(yīng)傳遞的非病毒基因傳遞體系;通過(guò)制備巰基化