2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、第一部分從肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞中提取線粒體方法的對比
   目的:對比提取肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞(PASMC、FASMC、FVSMC)線粒體方法的成功率差異。
   方法:斷頸法處死150g左右的SD雄性大鼠,分離肺動脈、股動脈、股靜脈血管放置于冰浴的D-Hank’s液中,在顯微鏡下去除血管外膜內膜,獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿,勻漿后加入蛋白酶抑制劑cocktail。勻漿液放入EP管,4

2、℃600g離心5min,取上清置于另一EP管內,4℃5000g離心10min,所獲沉淀即為線粒體。方法改動:梯度離心時兩次離心力改為1000g,10min/10000g,15min;600g,5min/7000g,10min兩種搭配。
   結果:在三種離心速度搭配的改動中,線粒體提取成功率有顯著提高。離心力搭配為600g,5min/5000g,10min時,成功率為47.4%;離心力搭配為1000g,10min/10000g,

3、15min時,成功率為50%;離心力搭配為600g,5min/7000g,10min時,成功率為89.8%。
   結論:當離心力搭配為600g,5min/7000g,10min時,提取線粒體的成功率最高。
   第二部分肺動脈、股動脈、股靜脈平滑肌細胞中線粒體數量和活性的差異
   目的:1.提取線粒體后對比PASMC、FASMC、FVSMC中線粒體數量的差異。2.用ELISA測定檸檬酸合成酶(CS)含量間接反

4、應線粒體含量。3.通過對比三種平滑肌細胞中線粒體琥珀酸脫氫酶(SDH)的活性差異,間接反映三種平滑肌細胞中線粒體活性的差異。
   方法:1.線粒體的提?。簲囝i法處死150g的SD雄鼠,取出肺動脈、股動脈、股靜脈,放置于冰浴的D-Hank’s液中,在顯微鏡下去除血管外膜、內膜,獲得平滑肌層。平滑肌層放入緩沖液中勻漿,勻漿后加入蛋白酶抑制劑,之后勻漿液放入EP管4℃600g離心5min,取出上清液放入新的EP管,4℃7000g離心

5、10min,所獲沉淀即為平滑肌層線粒體。2.線粒體計數:線粒體重懸于100μL配好的Mito-track-green染料中,放置在37℃
   孵育30min,染色結束后,4℃7000g離心10min,棄去上清,沉淀重懸于勻漿緩沖液,震蕩混勻后4℃7000g離心15min,即獲得被Mito-track-green著染的純化線粒體。取獲得的已染色的線粒體懸液10μL加入細胞計數板,在熒光顯微鏡下觀察并計數數熒光亮點,之后通過細胞計

6、數板計數得出線粒體懸液濃度。3.蛋白濃度測定:取第一次離心后所得的上清液40μL測定蛋白含量。線粒體數/蛋白質量=單位質量蛋白所含的線粒體數。4.檸檬酸合成酶含量的測定:取1步驟中第一次離心后的上清1mL,分為五份,-20℃保存,按ELISA試劑盒說明書測檸檬酸合成酶含量。5.琥珀酸脫氫酶活性測定:將提取的線粒體重懸于100μL組織裂解液,4℃冰浴中裂解1小時,之后4℃120000r/min離心5min。取40μL上清液測蛋白濃度,50

7、μL上清液測SDH活性。活性測定方法按照試劑盒說明書操作。
   結果:1.線粒體計數結果:PASMC中線粒體數為2×106個/mg pro(n=5),F(xiàn)ASMC中線粒體數為3.5×106個/mg pro(n=5),F(xiàn)VSMC中線粒體數為5.6×106個/mg pro(n=5);三種血管平滑肌細胞線粒體數量存在顯著性差異(p<0.05)。
   2.檸檬酸合成酶含量測定結果:(1)PASMC中CS含量為4.43ng/mg

8、 pro、FASMC中CS含量為8.46ng/mg pro,F(xiàn)VSMC中CS含量為7.23ng/mg pro。PASMC與FASMC兩者間的差異有統(tǒng)計學意義(n=3,p<0.05);(2)PASMC中單個線粒體CS含量為1.99×10-3pg、FASMC中單個線粒體CS含量為1.27×10-3pg、FVSMC中單個線粒體CS含量為2.40×10-3pg,F(xiàn)ASMC與FVSMC兩者間有差異(n=3,p<0.05)。
   3.琥珀

9、酸脫氫酶活性檢測結果:FASMC與FVSMC中SDH活性比PASMC中SDH活性高,F(xiàn)ASMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的210.36%(n=6,p<0.05);FVSMC中SDH活性是PASMC中SDH活性的243.45%(n=9,p<0.05)。
   結論:1.股靜脈血管平滑肌中線粒體數量最多,股動脈其次,肺動脈最少。2.PASMC中CS含量最低,F(xiàn)ASMC中CS含量最高;就單個線粒體而言,F(xiàn)VSMC中CS含量最

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