雙黃連影響兔組織籠感染模型中左氧氟沙星對金黃色葡萄球菌的耐藥突變選擇及grlA、grlB、gyrA、gryB基因突變的作用.pdf

1、目的:探討高中低劑量雙黃連聯用左氟沙星與單用左氧氟沙星作用于感染動物體，對金黃色葡萄球菌ATCC29213的MSW及grlA、grlB、gyrA、gyrB基因突變的影響。以期為中藥改善喹諾酮類藥物耐藥提供科學依據，為臨床減少細菌耐藥性的產生提供一種新的治療途徑。
　　方法:建立兔組織籠模型，以金黃色葡萄球菌ATCC29213感染，分為生理鹽水陰性對照組，單用左氧氟沙星組(10mg·kg-1·d-1)，單用雙黃連組（85mg· kg

2、-1·d-1）,低劑量雙黃連聯用左氧氟沙星組(雙黃連42.5mg· kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg· kg-1·d-1)，中劑量雙黃連聯用左氧氟沙星組(雙黃連85mg·kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg·kg-1·d-1)，高劑量雙黃連聯用左氧氟沙星組(雙黃連170mg·kg-1·d-1+左氧氟沙星10mg· kg-1·d-1)，耳緣靜脈注射，連續(xù)給藥5天，比較低、中、高劑量雙黃連聯用左氧氟沙星與單用左氧氟沙星干預過程中，不同時

3、間不同組別金黃色葡萄球菌濃度變化曲線。抽取6組干預不同時間不同組別兔組織籠內金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)，增菌培養(yǎng)后，采用瓊脂平板二倍稀釋法測定連續(xù)7天（干預過程中和干預結束后兩天）相同時間點各組最低抑菌濃度(MIC)、防耐藥突變濃度(MPC)、聯合抑菌指數(SI=MPC/MIC)。以細菌菌落數、MIC、MSW(SI=MPC/MIC)作為統(tǒng)計學指標，用SPSS19.0軟件通過重復測量方差分析方法進行統(tǒng)計學分析，并用LSD進行組間兩兩比較。提取

4、干預結束后兩天組織籠內恢復生長的細菌DNA，應用PCR技術擴增野生型金黃色葡萄球菌和干預后兔組織籠內金黃色葡萄球菌，采用雙脫氧末端終止法測定和DNAMAN軟件分析grlA、grlB、gyrA、 gyrB基因序列，比較金黃色葡萄球菌ATCC29213及6組不同干預組兔組織籠內金黃色葡萄球菌grlA、 grlB、 gyrA、 gyrB基因序列突變情況與細菌耐藥性的關系。
　　結果:細菌菌落計數表明:生理鹽水陰性對照組的細菌菌落在10l

5、og10CFU·mL-1上下波動。而其他各組菌落曲線均位于陰性對照組下方，用LSD進行兩兩比較的結果顯示陰性對照組與其他各組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。單用雙黃連組第一至四天呈緩慢下降趨勢，下降至6log10CFU· mL-1水平維持波動。單用左氧氟沙星組第一至第四天細菌數量急劇下降至4log10CFU·mL-1，第五天有較大回升至6log10CFU· mL-1左右波動。不同濃度雙黃連聯用組在第一至五天菌落數均急劇下降，降至

6、3log10CFU·mL-1和2 log10CFU·mL-1水平維持波動，高濃度聯用組第五天未檢測到存活的菌落，菌落在停用藥后兩天均無回升趨勢。隨聯用雙黃連的劑量增加，菌落下降趨勢增大，組間差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。細菌MIC分析結果表明:陰性對照組MIC在0.146±0.015ug·mL-1附近有微弱波動，無明顯變化。單用左氧氟沙星組在第二天MIC出現急劇升高，由初始MIC(0.146±0.015ug·mL-1)于第三天上升

7、至1.000±0.122ug·mL-1即上升了約7倍，連續(xù)7天MIC整體處于上升趨勢終至1.236±0.061ug·mL-1，即最終上升了約9倍，與陰性對照組相比有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。單用雙黃連組曲線處于陰性對照組下方，但變化不大，無統(tǒng)計學差異(P=0.422＞0.05)。三組雙黃連聯用組MIC曲線均位于陰性對照組MIC曲線下方，與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低劑量聯用組前三天MIC在初始MIC附近變化不大

8、，之后降低至0.119±0.063ug· mL-1附近波動。中劑量聯用組第二天開始出現MIC降低，MIC降低至0.048±0.011 ug·mL-1,附近波動。高劑量聯用組于第二天MIC出現急劇下降，第四天MIC降低至0.036±0.018ug·mL-1,即下降了約3.9倍，第五、六、七天未檢測到細菌。隨聯用的雙黃連的劑量增大，MIC降低的趨勢增大，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。且中劑量聯用組和高劑量聯用組相對低劑量聯用組MIC降低

9、的時間明顯提前一天。細菌MSW分析結果表明:陰性對照組MSW在初始10.509±0.027附近有微弱波動，前后無明顯變化。單用左氧氟沙星組第二天MSW出現急劇升高，由初始10.546±0.060增大至21.502±0.472左右波動。與陰性對照組比較，MSW整體呈上升趨勢，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。單用雙黃連組曲線位于陰性對照組上方，但相差不大，無統(tǒng)計學差異(P=0.422＞0.05)。三組雙黃連聯用組MSW曲線均位于陰性對照

10、組MSW曲線下方，與陰性對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。低劑量聯用組前兩天在初始MSW(10.609±0.092)附近變化不大，第三天出現急劇下降第四天降低至7.604±0.083微弱波動。中劑量聯用組第二至五天MSW均處于明顯持續(xù)下降趨勢最終至3.246±0.096附近微弱波動。高劑量聯用組MSW于第二至四天急劇下降至2.254±0.049，第五、六、七未檢測到細菌。隨聯用的雙黃連的劑量增大，MSW降低的趨勢增大，差異有

11、統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，且中劑量和高劑量聯用組相對低劑量聯用組MSW降低的時間明顯提前一天。金黃色葡萄球菌ATCC29213和6組干預組兔織籠內金黃色葡萄球菌的grlA、grlB、gyrA、gyrB基因的分析結果表明:金黃色葡萄球菌ATCC29213，生理鹽水陰性對照組，雙黃連聯用組，單用雙黃連組grlA、 grlB、gyrA基因序列一致，單用左氧氟沙星組grlA基因序列發(fā)生了多處突變，grlB、gyrA基因序列發(fā)生了兩處點突變。g

12、rlA密碼子突變位點:Ala(29)→Ser, Ser(32)→Val,Asn(40)→Ala54,Gln(54)→Asn,Phe(61)→Ser,Asp(73)→Thr,His(78)→Asn,Ile(81)→Val,Ile(90)→Val,Asn(92)→Gly,Pro(95)→Ala,Lys(104)→Arg,Lys(104)→Arg,Leu(107)→Pro,Leu(108)→Ile,Ile(116)→Leu,Ser(123)→

13、Glu,Ile(125)→Val,Pro(126)→Ser,Tyr(128)→Phe,Thr(132)→Ser, Leu(133)→Glu,Ser(139)→Ala,Arg(140)→Ala,Asp(159)→Glu，Asn(165)→His，Tyr(175)→Arg,Asn(178)→Lys。grlB密碼子發(fā)生兩處突變:Tyr(114)→Phe，Leu(115)→MET.gyrA密碼子突變點:Pro(61)Pro→Thr。GyrB基因

14、序列分析顯示各實驗組與ATCC29213—致。
　　結論:雙黃連明顯降低金黃色葡萄球菌對左氧氟沙星的MSW、MIC，在一定用藥范圍內，越高濃度雙黃連與左氧氟沙星聯用，以上作用越強，因此聯合使用雙黃連可以增強左氧氟沙星對金黃色葡萄球菌耐藥敏感性。左氧氟沙星引起細菌耐藥性的產生可能與grlA基因中的多處點突變和grlB、gyrA的兩處點突變有關，可能與gyrB基因無關。中藥雙黃連能抑制左氧氟沙星誘導產生的金黃色葡萄球菌grlA、grl