高爾基體α-甘露糖苷酶Ⅰ介導HBV去甘露糖修飾以逃逸樹突狀細胞DC-SIGN免疫識別的研究.pdf

1、目的：
　　探尋高爾基體α甘露糖苷酶Ⅰ(Golgi MⅠ)介導的HBV(乙型肝炎病毒)的去甘露糖修飾，是否能使病毒逃逸樹突狀細胞(DCs)表面DC-SIGN的免疫識別及其機制。將DC-SIGN基因沉默后，觀察DCs在野生型HBV或高甘露糖型HBV刺激下的免疫指標，研究野生型HBV與高甘露糖型HBV對DC的成熟和免疫活化的影響，以及DC-SIGN在HBV感染中發(fā)揮的免疫作用。在課題組既往實驗的基礎上，通過尋找可能存在于HBe功能蛋白

2、基因序列中的促進宿主細胞Golgi MⅠ活性的核心片段，來初步探討Golgi MⅠ相關的HBV去甘露糖修飾，通過何種機制逃逸DC-SIGN對HBV的免疫識別及阻礙DCs免疫活化。
　　方法：
　　一、樹突狀細胞DC-SIGN的基因沉默及其對樹突狀細胞免疫功能的影響
　　1.分離健康人的外周血單個核細胞(PBMC)進行體外培養(yǎng)，以GM-CSF、白細胞介素-4(IL-4)和腫瘤壞死因子(TNF-α)將其誘導分化為DC；

3、r>　　2.構(gòu)建DC-SIGN基因沉默的siRNA序列，分組轉(zhuǎn)染DC細胞；
　　3.RT-PCR法檢測DC細胞內(nèi)DC-SIGNmRNA的表達，流式細胞術檢測DC細胞表面DC-SIGN的表達，選擇DC-SIGN沉默效果最好的序列進行后續(xù)試驗；
　　4.空白對照組、DC-SIGN基因沉默組與轉(zhuǎn)染無關siRNA序列組的DC細胞，以流式細胞術檢測表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達；
　　5.EL

4、ISA法檢測4中所述三組DC細胞分泌細胞因子IL-10與IL-12p70的水平；
　　6.MTT法檢測4中所述三組DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力；
　　7.Westernblot法檢測4中所述三組DC細胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達；
　　二、野生型與高甘露糖型HBV對DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹突狀細胞免疫功能的影響
　　1.體外培養(yǎng)HepG2.2.15細胞；
　　2.加入基夫堿母液至

5、HepG2.2.15細胞中，使基夫堿終濃度為5ug/ml，如此處理5天后收集HepG2.2.15培養(yǎng)上清液；
　　3.通過低溫超速離心法，從基夫堿處理的HepG2.2.15細胞提取獲得高甘露糖型HBV顆粒，從HepG2.2.15細胞提取獲得野生型HBV，并以熒光定量PCR法檢測HBV DNA滴度；
　　4.體外培養(yǎng)PBMC并誘導分化的DC分為DC-SIGN沉默與非沉默兩組，每組三個亞組：對照組、加野生型HBV組，加高甘露糖型

6、HBV組。在DC培養(yǎng)第5天將收獲HBV顆粒(調(diào)整濃度為5×106copies/ml)，加入到相應組的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第7天時，進行如下檢測；
　　5.流式細胞術檢測上述6個亞組中DC細胞表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達
　　6.ELISA法檢測上述6個亞組中DC細胞分泌細胞因子IL-10與IL-12p70的水平；
　　7.MTT法檢測上述6個亞組中DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力

7、；
　　8.Westernblot法檢測上述6個亞組中DC細胞NF-кB p65與p38的表達；
　　三、HBe基因片段中促進Golgi MⅠ活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　1.取出本實驗室保存的采用分子克隆的方法構(gòu)建并鑒定過的HBe功能蛋白的真核表達載體(質(zhì)粒)，分析表達的HBe蛋白結(jié)構(gòu)域；
　　2.Wingene軟件分析酶切位點，將HBe質(zhì)粒的基因序列切分為三段目的序列，分別在每段序列的上下游加入酶切位點

8、Xho I，BamH I。設計各序列引物，PCR擴增，將目的片段連接載體pEGFP-N1，構(gòu)建分別包含三個表達HBe亞片段的真核表達載體，依次命名為HBe-1、HBe-2、HBe-3，分別進行測序鑒定；
　　3.將上述3種含HBe亞片段的質(zhì)粒和含HBe全長的質(zhì)粒分別經(jīng)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染進入HepG2細胞內(nèi)，設置空白對照組，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細胞綠色熒光蛋白的表達；
　　4.RTPCR方法檢測轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)

9、粒后5組HepG2細胞Golgi MⅠ的2種亞型基因MAN1A1、MAN1A2的mRNA表達水平；
　　5.Western blot檢測轉(zhuǎn)染上述各質(zhì)粒后5組HepG2細胞MAN1A1、MAN1A2的蛋白表達水平；
　　結(jié)果：
　　一、樹突狀細胞DC-SIGN的基因沉默及其對樹突狀細胞免疫功能的影響
　　1.成功選擇了能使DC表面DC-SIGN基因沉默的siRNA序列。
　　2.用siRNA沉默DC-SIGN

10、，對以下指標無影響：DC表面CD1a、CD80、CD83、CD86、HLADR的表達水平、DC細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖能力、DC細胞IL-10及IL-12p70的分泌水平，以及DC細胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達水平。
　　二、野生型與高甘露糖型HBV對DC-SIGN基因非沉默與沉默的樹突狀細胞免疫功能的影響
　　1.DC-SIGN非基因沉默的亞組中，與高甘露糖型HBV干預的DC亞組相比，野生型HBV干預的DC亞組

11、，細胞表面分子CD80、CD83、CD86、CDla、HLA-DR的表達較低，細胞培養(yǎng)上清中IL-12p70的水平較低而IL-10的表達水平較高，細胞刺激同種異體淋巴細胞增殖的能力較弱，細胞內(nèi)NF-кB p65與p38的表達水平較低；
　　2.在DC-SIGN基因沉默的三個亞組中，野生型HBV干預的DCs與高甘露糖型HBV干預DCs，上述指標無明顯差異；
　　3.不論是否進行DC-SIGN基因沉默，不論用野生型HBV或高甘露

12、糖型HBV干預，與未用HBV干預的DC細胞相比，以HBV干預的DC，上述各指標表達均升高，具有明顯統(tǒng)計學差異；
　　三、HBe基因片段中促進Golgi MⅠ活性的核心序列質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定
　　1.成功構(gòu)建三種分別含有三段HBe亞片段多肽基因的真核表達載體，且成功地將此三種質(zhì)粒及含有HBe全長蛋白基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2細胞；
　　2.轉(zhuǎn)染了表達HBe全長或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細胞，不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒，與對照組

13、相比，HepG2細胞MAN1A1mRNA的表達量上升；且除HBe-1組外，HepG2細胞MAN1A2mRNA的表達量也上升。
　　3.轉(zhuǎn)染了表達HBe全長或片段多肽質(zhì)粒的HepG2細胞，不論轉(zhuǎn)染的是哪一種質(zhì)粒，與對照組相比，MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的表達量均上升；
　　4.HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后，其表達MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平平均值，均最接近轉(zhuǎn)染

14、HBe全長質(zhì)粒組HepG2細胞的水平；其中特別地，HBe-2轉(zhuǎn)染入HepG2細胞后，其表達MAN1A2蛋白的能力與HBe全長質(zhì)粒組無差異。
　　5.HBe-1、HBe-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，其表達MAN1A1mRNA、MAN1A2mRNA及MAN1A1蛋白、MAN1A2蛋白的水平，明顯低于HBe全長質(zhì)粒組的HepG2細胞。
　　結(jié)論：
　　1.siRNA對DC表面DC-SIGN進行基因沉默后，對DC細胞的免疫功能