人胚胎干細(xì)胞體外分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞過(guò)程中MicroRNA及基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、目的：
　　通過(guò)研究人胚胎干細(xì)胞體外定向分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞過(guò)程中microRNA及mRNA的表達(dá)譜情況，篩選差異表達(dá)microRNA及mRNA，并對(duì)感興趣microRNA及其靶mRNA進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證，從而試圖發(fā)現(xiàn)一些調(diào)控人胚胎干細(xì)胞向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵microRNA及mRNA，為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷及再生提供新的治療靶點(diǎn)。
　　方法：
　　使用小分子化合物SB4315422μM

2、、LDN1931890.3μM、CHIR990212mM及化學(xué)成分限定培養(yǎng)體系于體外在飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持作用下先將人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞。上述三種小分子化合物（濃度不變）再結(jié)合另外兩種小分子化合物RA0.1μM，Purmorphamine0.5μM在新鮮飼養(yǎng)層細(xì)胞的支持下將神經(jīng)上皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化為脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞，然后撤去SB431542、LDN193189、CHIR99021，保留RA、Purmorphamine(濃度

3、不變)懸浮培養(yǎng)一周提高純度，收集hESC及神經(jīng)上皮、脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞這三個(gè)關(guān)鍵時(shí)期標(biāo)本，進(jìn)行RNA抽提，對(duì)RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)后分別進(jìn)行microRNA和mRNA表達(dá)譜檢測(cè)；使用miRanda、miRbase、targetScan數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所檢microRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)；將預(yù)測(cè)所得靶基因和所檢mRNA芯片聯(lián)合分析；對(duì)mRNA芯片進(jìn)行生物信息學(xué)分析，信號(hào)通路分析，構(gòu)建microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。挑選不同分化階段差異表達(dá)microRNA

4、及相應(yīng)靶基因，進(jìn)行real-time PCR驗(yàn)證。
　　結(jié)果：
　　（1）人胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)上皮細(xì)胞分化過(guò)程中microRNA表達(dá)譜及基因表達(dá)譜發(fā)生明顯改變。347個(gè)microRNA下調(diào)大于2倍，134個(gè)microRNA上調(diào)大于2倍。對(duì)應(yīng)的基因芯片中，2252個(gè)基因上調(diào)表達(dá)大于2倍；2404個(gè)基因下調(diào)表達(dá)大于2倍。Hsa-miR-141-3p下調(diào)解除了對(duì)ZEB2的抑制，hsa-miR-365b-3p下調(diào)解除了對(duì)PAX6的抑制

5、參與人胚胎干細(xì)胞分化為神經(jīng)上皮細(xì)胞。
　?。?）神經(jīng)上皮細(xì)胞向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞分化過(guò)程中microRNA及基因表達(dá)譜發(fā)生明顯改變：189個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào)大于2倍；298個(gè)microRNA上調(diào)大于2倍。對(duì)應(yīng)的基因芯片中，6098個(gè)基因上調(diào)表達(dá)大于2倍；5963個(gè)基因下調(diào)表達(dá)大于2倍。hsa-miR-93上調(diào)抑制了PTEN基因的表達(dá)，從而參與神經(jīng)上皮細(xì)胞向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的分化。Hsa-miR-9-3p、hsa-miR-3

6、0e-3p表達(dá)下調(diào)，其分別對(duì)應(yīng)的靶基因HOXB4、NKX6-1 real-time PCR證實(shí)表達(dá)均上調(diào)，提示上述microRNA表達(dá)下調(diào)解除了對(duì)其靶基因的抑制從而參與神經(jīng)上皮細(xì)胞向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞的分化。
　　結(jié)論：
　　（1）Hsa-miR-342-5p,hsa-miR-345-3p,ZEB2等大量的microRNA及基因參與了人脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元祖細(xì)胞的發(fā)育。
　?。?）Hsa-miR-141-3p下調(diào)解除了對(duì)Z