Egr-1介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)Survivin促進(jìn)血管形成實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、惡性腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤是顱內(nèi)常見(jiàn)的原發(fā)腫瘤，外科手術(shù)結(jié)合術(shù)后放療、化療，患者的中位生存時(shí)間一般少于18個(gè)月。因此迫切需要對(duì)其發(fā)病機(jī)理及治療環(huán)節(jié)進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，尋找新型的治療方式，突破目前治療中遇到的瓶頸，以提高惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。
　　血管形成是一個(gè)復(fù)雜的生理進(jìn)程，是指誘導(dǎo)已經(jīng)存在的血管，形成新生血管的過(guò)程。正常條件下，血管形成被嚴(yán)格調(diào)控并在刺激因素和抑制因素之間維持一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)刺激因素占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位（血管形成

2、啟動(dòng)），就會(huì)導(dǎo)致一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)（基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及管腔形成）的發(fā)生。膠質(zhì)細(xì)胞瘤屬于血管增殖極為活躍的實(shí)體瘤，血管形成在膠質(zhì)細(xì)胞瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。
　　Survivin是IAP家族最小的成員，具有抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)有絲分裂的功能。并且Survivin在腫瘤組織中高表達(dá)、于正常的終末分化組織中為低表達(dá)的特點(diǎn)，使之有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。我們?cè)谇捌诘难芯恐邪l(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin與膠質(zhì)細(xì)胞瘤的病理級(jí)別呈正相

3、關(guān)，和膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的微血管密度亦呈正相關(guān)，并且干涉膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin，不僅可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，降低其在裸鼠中的成瘤性，并且可以降低移植瘤組織中的微血管密度，這提示我們?cè)谀z質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin有可能參與瘤組織中血管形成的調(diào)節(jié)。但是據(jù)此尚不能確定膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin對(duì)瘤組織內(nèi)血管形成的作用。根據(jù)以往文獻(xiàn)報(bào)道，野生型Survivin可以上調(diào)胰島素細(xì)胞中Egr-1的表達(dá)。Egr-1是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子，很多促

4、血管形成因子的啟動(dòng)子區(qū)都有Egr-1的結(jié)合位點(diǎn)。據(jù)此我們推測(cè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin可以通過(guò)Egr-1來(lái)調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中促血管形成因子的表達(dá)及分泌，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的血管形成。
　　目的：探索膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin是否可以影響瘤組織中的血管形成，并探討其發(fā)揮作用的機(jī)制。
　　方法：采用脂質(zhì)體法，將Survivin的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Survivin，Egr-1的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Eg

5、r-1，同時(shí)攜帶Survivin和Egr-1shRNA表達(dá)框的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Survivin-EgrshRNA及空載體pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染SHG44細(xì)胞，將Survivin的干涉載體pRNAT-SurvivinshRNA、Egr-1的干涉載體pRNAT-Egr-1shRNA及無(wú)關(guān)插入序列載體Prnat-NSsi和空載體pRNAT-U6.1/Neo分別轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，通過(guò)G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染不同克隆的細(xì)胞系。分別采

6、用MTT法、Transwell小室、血管管狀形成實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)親代SHG44細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細(xì)胞、親代U251細(xì)胞、抑制Survivin的U251細(xì)胞對(duì)HUVECs增殖、遷移及形成血管功能的影響。采用qPCR檢測(cè)各組細(xì)胞中三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的mRNA水平，采用Westernblot檢測(cè)各組細(xì)胞中三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的蛋白表達(dá)水平，采用ELISA方法檢測(cè)三種促血管形成

7、因子VEGF、bFGF和PDGF在相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中的水平。將各組細(xì)胞接種于裸鼠背部，構(gòu)建荷瘤裸鼠模型，觀察各組瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，并測(cè)定移植瘤體積，檢測(cè)瘤組織內(nèi)MVD，Ki67，Survivin，Egr-1及三種促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：將HUVECs和膠質(zhì)瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，強(qiáng)制表達(dá)Survivin的SHG44細(xì)胞對(duì)HUVECs增殖、遷移及血管形成的刺激作用明顯強(qiáng)于親代SHG44細(xì)胞，親代U2

8、51細(xì)胞對(duì)HUVECs增殖、遷移及血管形成的刺激作用明顯強(qiáng)于抑制Survivin表達(dá)的U251細(xì)胞。Westernblot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細(xì)胞中可以檢測(cè)到bFGF表達(dá)，未檢測(cè)出VEGF和PDGF表達(dá)，轉(zhuǎn)染空載體的SHG44細(xì)胞和親代SHG44細(xì)胞中始終未檢測(cè)出VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)；轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細(xì)胞中可以檢測(cè)到VEGF和bFGF表達(dá)，未檢測(cè)出PDGF表達(dá)，轉(zhuǎn)染空載體的SHG44細(xì)胞和

9、親代SHG44細(xì)胞中始終未檢測(cè)出VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)。qPCR檢測(cè)的VEGF、bFGF和PDGF轉(zhuǎn)錄水平，ELISA檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量變化與Westernblot檢測(cè)的結(jié)果一致。Westernblot檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干涉Survivin表達(dá)的U251細(xì)胞中VEGF、bFGF表達(dá)下調(diào)，PDGF表達(dá)無(wú)變化，轉(zhuǎn)染空載體、無(wú)關(guān)序列的U251細(xì)胞和親代U251細(xì)胞中VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)

10、無(wú)變化；干涉Egr-1的U251細(xì)胞中VEGF和bFGF表達(dá)下調(diào)，PDGF表達(dá)無(wú)變化，轉(zhuǎn)染空載體、無(wú)關(guān)序列的U251細(xì)胞和親代U251細(xì)胞中VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)無(wú)變化。qPCR檢測(cè)的VEGF、bFGF和PDGF轉(zhuǎn)錄水平，ELISA檢測(cè)相應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中VEGF、bFGF和PDGF的含量變化與Westernblot檢測(cè)的結(jié)果一致。Westernblot、qPCR和ELISA檢測(cè)的結(jié)果顯示，與強(qiáng)制表達(dá)Survivin的SHG4

11、4細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染既表達(dá)Survivin同時(shí)干涉Egr-1表達(dá)的SHG44細(xì)胞中bFGF明顯降低。將不同的細(xì)胞接種裸鼠后，轉(zhuǎn)染Survivin或者轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯快于親代SHG44細(xì)胞。干涉Survivin的U251細(xì)胞與親代細(xì)胞相比，生長(zhǎng)速度明顯減慢，干涉Egr-1的U251細(xì)胞與親代細(xì)胞相比的生長(zhǎng)速度相比沒(méi)有差異。轉(zhuǎn)染既表達(dá)Survivin同時(shí)干涉Egr-1的SHG44細(xì)胞與強(qiáng)制表達(dá)Survivin的SHG4

12、4細(xì)胞相比，其生長(zhǎng)速度明顯減慢。Ki67的免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與親代SHG44細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Survivin或轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細(xì)胞中的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞增多，與親代U251細(xì)胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251細(xì)胞中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞減少，轉(zhuǎn)染既表達(dá)Survivin同時(shí)干涉Egr-1的SHG44細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44相比Ki67陽(yáng)性細(xì)胞減少。MVD結(jié)果表明，與親代SHG44細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Sur

13、vivin或轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細(xì)胞中的MVD增多，與親代U251細(xì)胞相比，干涉Survivin或干涉Egr-1的U251細(xì)胞中MVD減少，轉(zhuǎn)染既表達(dá)Survivin同時(shí)干涉Egr-1的SHG44細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細(xì)胞相比MVD減少。半定量免疫組化評(píng)分結(jié)果證明，與親代SHG44細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44細(xì)胞中VEGF、bFGF、PDGF表達(dá)上調(diào)，轉(zhuǎn)染Egr-1的SHG44細(xì)胞中VEGF、bFG

14、F、PDGF表達(dá)上調(diào)；轉(zhuǎn)染既表達(dá)Survivin同時(shí)干涉Egr-1的SHG44細(xì)胞與僅轉(zhuǎn)染Survivin的SHG44相比，VEGF、bFGF、PDGF表達(dá)下調(diào)；與親代U251細(xì)胞相比，干涉Survivin的U251細(xì)胞中VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)下調(diào)；干涉Egr-1的U251細(xì)胞中VEGF、bFGF和PDGF表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin在體外可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及管狀形成等功能，在體內(nèi)可以提

15、高瘤組織內(nèi)MVD。這些作用的發(fā)揮是通過(guò)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的Survivin上調(diào)促血管形成因子VEGF、bFGF和PDGF的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)及分泌實(shí)現(xiàn)的。Survivin發(fā)揮促進(jìn)這些因子的表達(dá)及分泌的功能時(shí)，需要轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的介導(dǎo)。我們的實(shí)驗(yàn)首次證明了膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Survivin，在轉(zhuǎn)錄因子Egr-1的介導(dǎo)下，可以促進(jìn)瘤細(xì)胞中VEGF、bFGF和PDGF等因子的表達(dá)及分泌，進(jìn)而促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的血管形成，這為抗Survivin的靶向治療提供了