基于逆向相變和自裂解的重組蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用.pdf

1、劉文?。夯谀嫦蛳嘧兒妥粤呀獾闹亟M蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用 !基于逆向相變和自裂解的重組蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用博士研究生：劉文俊導(dǎo)師：孫懷昌摘要重組蛋白表達(dá)是蛋白功能研究、藥物研發(fā)等研究領(lǐng)域的重要環(huán)節(jié)，但目前重組蛋白的純化面臨巨大挑戰(zhàn)。常用的重組蛋白純化方法主要有親和層析法，其基本原理是將目的蛋白與某種標(biāo)簽蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，然后利用特定配體偶聯(lián)的親和柱純化融合蛋白，其優(yōu)點是純化效率較高，但不僅需用昂貴的親和樹脂，難以規(guī)?；?/p>

2、制備，而且通常需用蛋白酶切除標(biāo)簽蛋白，才能獲得有活性的目的蛋白。然而，所用蛋白酶不僅價格昂貴，而且需用其他方法將其從終產(chǎn)物中去除，這不僅使重組蛋白純化進(jìn)一步復(fù)雜化，而且額外增加制備成本。因此，建立簡單、經(jīng)濟(jì)的重組蛋白純化方法是生物制藥研究領(lǐng)域迫切需要解決的問題，對獸用重組蛋白更是如此。類彈性蛋A ( e l a s t i n ．1 i k e p o l y p e p t i d e s ，E L P ) 具有逆向溫度相變特性，其融

3、合蛋白能隨溶液溫度或鹽濃度改變從可溶性狀態(tài)變?yōu)椴蝗苄誀顟B(tài)，因此可用離心、超濾等簡單、快速、經(jīng)濟(jì)的方法進(jìn)行融合蛋白分離，且便于規(guī)?；苽?。蛋白內(nèi)含肽( i n t e i n ) 等白加工元件( s e l f - p r o c e s s i n gm o d u l e ，S P M ) 具有可誘導(dǎo)水解活性，能在溫度、p H 、鹽離子等誘導(dǎo)下將功能蛋白從前體蛋白上切割下來，因此能用于融合標(biāo)簽蛋白的裂解和目的蛋白的釋放。因此，將E L

4、 P 逆向相變特性與S P M 自裂解活性相結(jié)合，建立的重組蛋白表達(dá)與純化系統(tǒng)不僅可大大簡化重組蛋白的純化，而且能顯著降低生產(chǎn)成本。本研究先利用E L P ．內(nèi)含肽融合表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)和純化得到人防御素3 ( h u m a n 1 3d e n f e s i n3 ，H B D 3 ) 和非洲豬瘟病毒K 2 0 5 R 蛋白，然后構(gòu)建E L P 與腦膜炎奈瑟球菌F r p C 蛋AS P M 融合表達(dá)載體，并以綠色熒光蛋白( g

5、r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ，G F P ) 、豬I g GF c 片段( F c p o r t i o n o f p o r c i n eI g G ，p F c )和H B D 3 代表不同結(jié)構(gòu)和分子量的目的蛋白，對融合蛋白的分離純化和目的蛋白的裂解釋放等條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，研究結(jié)果如下：類彈性蛋白和△I ．C M 內(nèi)含肽介導(dǎo)的人防御素3 的表達(dá)與純化：將H B D

6、 3 成熟肽編碼序列直接插入引進(jìn)的E L P 與△I ．C M 內(nèi)含肽融合表達(dá)載體，將重組質(zhì)粒p E T ．E 1 ．H B D 3 轉(zhuǎn)化B L R 大腸桿菌，在2 0 ℃利用I P T G 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，在優(yōu)化條件下利用E L P 的溫度敏感逆向相變循環(huán)( I T C ) 純化融合蛋白，以內(nèi)含肽自體裂解特性釋放目的蛋白，用瓊脂擴散劉文?。夯谀嫦蛳嘧兒妥粤呀獾闹亟M蛋白表達(dá)和純化系統(tǒng)的建立與應(yīng)用 三類彈性蛋白和自加工元件介導(dǎo)的豬I

7、g G F e 片段的表達(dá)與純化：根據(jù)豬I g G F e 片段編類彈性蛋白和自加工元件介導(dǎo)的人防御素3 的表達(dá)與純化：用生物信息學(xué)軟件將l O O p g ／m L 、2 5 “g ／m L 和5 0 } I ∥m L 。這些研究結(jié)果說明，S P M —E L P 融合表達(dá)系統(tǒng)可用于H B D 3羹警磊? 萎蓁囂耋魯：喜詈：蕘囂? 蓋喜蓁呈望罷了簍嘉薹苫制備巡淤淵關(guān)鍵詞：類彈性蛋白：自剪切元件；融合表達(dá)載體；重組蛋白制備 、! j ：