基于ELP-Hsp90α融合蛋白IBDV濃縮和純化方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、傳染性法氏囊病(IBD)是雞的一種高度接觸性傳染病，主要侵害3～6周齡雞的法氏囊，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫抑制、免疫失敗和對其他病原的易感性增強(qiáng)，給世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳染性法氏囊病病毒(IBDV)是雙RNA病毒科成員，病毒顆粒無囊膜，對熱、pH3～9和有機(jī)溶劑穩(wěn)定，因此可用氯仿和聚乙二醇沉淀和濃縮，用蔗糖或氯化銫密度梯度離心和凝膠過濾等方法純化，但這些方法具有費(fèi)時(shí)、費(fèi)錢和回收率低等缺點(diǎn)。病毒受體結(jié)合捕捉(Virus receptor-

2、bindingcapture)技術(shù)利用病毒受體偶聯(lián)的磁珠等固相載體從組織和環(huán)境樣品中捕捉病毒，具有簡單、快速和經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，與PCR等技術(shù)相結(jié)合已成功用于病毒的環(huán)境監(jiān)測。用類彈性蛋白多肽(ELP)取代固相載體，本課題組建立了更為簡單、經(jīng)濟(jì)的腺病毒濃縮與純化方法。熱應(yīng)激蛋白90α(Hsp90α)是IBDV受體復(fù)合物成分，本課題組的前期研究結(jié)果顯示Hsp90αC端444個(gè)氨基酸區(qū)域(C444)能與IBDV結(jié)合，為建立Hsp90α結(jié)合IBDV捕

3、捉方法奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究將C444區(qū)分為3段與ELP進(jìn)行融合表達(dá)，在進(jìn)一步明確IBDV結(jié)合區(qū)的基礎(chǔ)上，用其ELP融合蛋白建立了IBDV快速濃縮與純化方法。將Hsp90α的C444區(qū)分為283-449、356-606和597-728位氨基酸3個(gè)部分重疊的片段，將PCR擴(kuò)增的編碼序列分別與ELP序列融合，構(gòu)建原核表達(dá)載體pELP-283-449、pELP-356-606和pELP-597-728。將重組載體轉(zhuǎn)化BLR大腸桿菌，用

4、IPTG在20℃誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，利用ELP的溫度敏感可逆相變循環(huán)(ITC)獲得了純度較高的融合蛋白ELP-283-449、ELP-356-606和ELP-597-728。分別將純化的融合蛋白與IBDV進(jìn)行共孵育，利用ITC沉淀融合蛋白-病毒復(fù)合物，經(jīng)RT-PCR檢測證明，ELP-283-449融合蛋白能與IBDV結(jié)合。將不同濃度的ELP-283-449融合蛋白與IBDV混合，在不同pH和溫度下孵育不同時(shí)間，用ITC沉淀結(jié)合的IBDV，

5、病毒滴定結(jié)果顯示ELP-283-449結(jié)合IBDV的最佳條件為160μg/mL蛋白、16℃、pH7.0和1h。將沉淀的融合蛋白-IBDV復(fù)合物在不同pH和溫度下洗脫不同時(shí)間，病毒滴定結(jié)果顯示洗脫IBDV的最佳條件為22℃、pH9.0和30min。在優(yōu)化條件下用ELP-283-449融合蛋白分別從IBDV感染細(xì)胞培養(yǎng)上清和裂解細(xì)胞中濃縮和純化病毒，病毒滴定結(jié)果顯示IBDV的回收率分別為75.4％和71.7％。在優(yōu)化條件下進(jìn)行IBDV洗脫，