傳染性喉氣管炎（ILTV）重組雞痘病毒（rFPV-gB-gD-IgG）和DNA（pcDNA-gB）疫苗對雞免疫效果的研究.pdf

1、傳染性喉氣管炎(Inctious laryngotractheitis，ILT)是由傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)引起的雞的一種急性上呼吸道傳染病。該病分布于世界各地，被OIE列為B類傳染病。上世紀60年代，我國也發(fā)現(xiàn)本病。此后，相繼在許多省市流行，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前國內(nèi)外主要使用弱毒疫苗預防本病，但它們都存在著疫苗株毒力偏強、潛伏感染、易于返祖以及疫苗株和野毒株無法鑒別的缺點，從而不利于ILT的根除。隨著分子生物學

2、的發(fā)展，利用基因工程疫苗預防ILT已成為人們的共識。其中重組病毒活疫苗由于其自身優(yōu)勢，成為防制傳染病的研究熱點；而核酸疫苗也越來越受到研究者的關注。本研究利用雞痘病毒弱毒疫苗株282 E4株為載體，構建了表達ILTV煙臺株gB及gD主要抗原表位基因和雞IgG重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒；并構建了包含ILTV主要抗原基因的DNA疫苗，檢測了兩種疫苗單獨或聯(lián)合使用時，誘導雞產(chǎn)生的體液免疫和細胞免疫情況。研究主要包括以下幾個方面： 1

3、.傳染性喉氣管炎病毒煙臺株g B基因的克隆和D N A疫苗的構建 以傳染I陛喉氣管炎病毒(ILTV)煙臺株基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的ILTVSA-2株基因序列設計并合成l對引物，在上下游分別添加Kpn Ⅰ和ApaⅠ酶切位點，PCR擴增出一條2.7kb的片段，測序結果表明：gB基因長2619bp，包含完整的閱讀框架，編碼873個氨基酸。將該片段亞克隆到pcDNA3.5真核表達載體中，酶切分析表明成功構建了真核表達質粒pcDN

4、A-gB。參照《分子克隆》大量提取質粒pcDNh-gB轉染COS-7細胞，間接免疫熒光表明該蛋白獲得表達，為下一步DNA免疫奠定了基礎。 2.目的片段的選取及重組雞痘病毒轉移載體pEr-gB-gD-IgG的構建 以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)煙臺株基因組DNA為模板，根據(jù)已發(fā)表的ILTVSA-2株基因序列設計并合成2對引物，分別擴增其gB和gD的主要抗原表位基因，同時人工合成IgG重鏈恒定區(qū)第900～1400基因。在g

5、B上游引物5’端添加ATG GCG，gD上游引物5’端設計一個9個氨基酸的linker(-GSLAGALGL-)，在合成的IgG重鏈恒定區(qū)基因3’端添加TAA，使gB及gD主要抗原表位基因與IgG重鏈恒定區(qū)基因連接后形成一個完整的閱讀框架。將gB和gD片段分別亞克隆到pBluescript Ⅱ SK(十)中，得到重組質粒pSK-gB-gD。然后將從重組質粒pSK-gB-gD酶切回收得到的gB-gD基因片段和人工合成的IgG重鏈恒定區(qū)片段

6、亞克隆到雞痘病毒轉移質粒載體pEFgptl2s中。經(jīng)酶切分析和PCR鑒定，表明已成功構建了重組雞痘病毒轉移載體pEF-gB-gD-IgG，為進一步在細胞中轉染并獲得表達傳染性喉氣管炎病毒gB及gD主要抗原表位基因和雞IgG重鏈恒定區(qū)基因的重組雞痘病毒奠定了基礎。3.目的片段在重組雞痘病毒中的表達及重組病毒生物學特性的研究 利用脂質體法，將構建好的重組雞痘病毒轉移載體pEF-gBgD-IgG轉染已感染雞痘病毒282E4疫苗株2h的次代雞

7、胚成纖維細胞，待出現(xiàn)明顯病變后收毒，用藥物篩選培養(yǎng)基(MXHAT)在24孔板上進行連續(xù)篩選純化，得到重組病毒rFPV-gBgD-IgG。利用PCR以及ILTV陽性血清和熒光標記羊抗雞IgG進行間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定，可見陽性重組病毒表達產(chǎn)物產(chǎn)生特異性熒光，同時分別擴增出了相應的目的片段。Western blot檢測結果顯示，目的片段在重組雞痘病毒感染的CEF中也獲得了表達。以上結果表明：成功構建了表達ILTVgB及gD主要抗原表

8、位基因扣IgG基因的重組雞痘病毒且表達產(chǎn)物具有免疫原性。連續(xù)傳10代后，重組病毒在2％MEM和2％MXHAT選擇性培養(yǎng)基中均生長良好，與親本株FPV出現(xiàn)病變的時間及病毒滴度基本達到一致，表明外源基因的引入不影響雞痘病毒的復制，且構建的重組病毒具較好的穩(wěn)定性，從而為傳染性喉氣管炎新型基因工程疫苗的研制打下了良好的基礎。4.重組雞痘病毒和DNA疫苗對雞的免疫效果試驗雞50只四周齡非免疫雞隨機分成5組，每組10只。第一組經(jīng)點眼滴鼻方式接種IL

9、T毒疫苗；第二組經(jīng)肌肉注質粒peDNA-gB；第三組經(jīng)翅皮下注射接種重組雞痘病毒rFPV-gBgD-IgG；第四組rFPV-gBgD-IgG/peDNA-gB共免疫雞；第五組經(jīng)肌肉注射生理鹽水。于免疫兩周后，每間隔一周每組隨機取5只雞經(jīng)靜脈采血分離血清，ELIsA檢測實驗雞的抗體產(chǎn)生和滴度變化表明：質粒組和重組雞痘病毒組免疫后第二周血清抗體為陽性，而對照組均為陰性，弱毒疫苗組在免疫后第三周血清抗體為陽性，各免疫組抗體水平可持續(xù)到第9周。