“濁毒”立論組方經(jīng)相關(guān)信號(hào)通路抑制DMN致肝纖維化及HSC活化的作用研究.pdf

1、肝纖維化(liverfibrosis/hepaticfibrosis)是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展所共有的病理改變和必經(jīng)途徑，雖是可逆的病理過程，但治療上仍缺乏有效、副作用小的藥物。導(dǎo)師李佃貴教授首創(chuàng)了中醫(yī)“濁毒”理論，他經(jīng)多年臨證認(rèn)為，濁毒內(nèi)蘊(yùn)是肝纖維化的主要病機(jī)之一。以化濁解毒法為指導(dǎo)，選用中藥組成化濁解毒方治療肝纖維化取得了滿意的療效，但其治療機(jī)制尚未明確。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)作為成纖維細(xì)胞/

2、肌成纖維細(xì)胞的主要來源，是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的合成與降解失衡是肝纖維化的主要病理改變。多種細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子是肝纖維化的關(guān)鍵因子，多條信號(hào)通路參與了肝纖維化的調(diào)控過程，它們被確認(rèn)為肝纖維化形成的重要靶點(diǎn)。本論文分三個(gè)部分，從體內(nèi)、體外不同水平上選取部分關(guān)鍵靶點(diǎn)，觀察了化濁解毒方抗肝纖維化的作用和機(jī)制，為化濁解毒法和“濁毒”理論治療肝纖維化提供了依據(jù)。

3、　　 第一部分:化濁解毒方經(jīng)JAK/STAT通路抑制DMN致大鼠肝纖維化的作用研究
　　 目的:通過觀察化濁解毒法組方對(duì)二甲基亞硝胺（DMN）致大鼠肝纖維化模型中肝組織Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)、Ⅲ型膠原蛋白(ColⅢ)mRNA以及JAK2/STAT3蛋白的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)化濁解毒方對(duì)大鼠肝纖維化的調(diào)節(jié)作用，探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:清潔級(jí)SD雄性大鼠70只，分為4組，即:正常對(duì)照組(A組)、模型對(duì)照組（B組）、

4、復(fù)方鱉甲軟肝片組（C組）、化濁解毒方組（分為等效、二倍、四倍劑量組，即D1、D2、D3組）、，除A組外，各組均予1％DMN10mg/kg腹腔內(nèi)注射，實(shí)驗(yàn)第1周連續(xù)造模3天，第2到6周，每周連續(xù)造模2天，第5到8周，每天等體積灌胃給與不同藥物。第8周末處死大鼠并取新鮮肝組織，用Masson染色觀察肝組織病理情況;運(yùn)用RT-PCR法檢測(cè)肝組織中ColⅠ、ColⅢmRNA的表達(dá);用Western-blot法檢測(cè)JAK2/STAT3蛋白表達(dá)情況

5、。
　　 結(jié)果:
　　 1.肝組織及病理學(xué)情況觀察:肉眼觀察A組大鼠肝臟表面光滑、質(zhì)韌，色鮮紅;B組大鼠肝臟表面有顆粒狀結(jié)節(jié)，質(zhì)硬;D2組受試大鼠肝臟表面散在細(xì)砂粒樣結(jié)節(jié)，質(zhì)稍硬，色暗紅。Masson染色情況顯示:A組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊;B組纖維縱膈較多，纖維組織增粗、包繞肝小葉;D1、D2和C組纖維縱膈均較B組減輕，纖維條索變細(xì);D3組纖維條索較粗。
　　 2.化濁解毒方對(duì)大鼠肝組織中ColⅠ、C

6、olⅢmRNA表達(dá)的影響:與A組相比，B組ColⅠ、ColⅢ表達(dá)均明顯增多(P＜0.01)。與B組相比，C及D1組ColⅠ、ColⅢ表達(dá)均降低(P＜0.05);D2組ColⅠ、ColⅢ表達(dá)顯著降低(P＜0.01);D3組ColⅠ、ColⅢ表達(dá)降低不明顯(P＞0.05)。
　　 3.化濁解毒方對(duì)大鼠肝組織中JAK2、STAT3蛋白表達(dá)的影響:與A組相比，B組JAK2、STAT3蛋白表達(dá)均明顯增多(P＜0.01)。與B組相比，D1組

7、JAK2蛋白表達(dá)降低(P＜0.05);C、D2組JAK2蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);除C組外，各給藥組STAT3蛋白表達(dá)較B組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:化濁解毒方能夠改善DMN致大鼠肝纖維化的程度，可以不同程度的改善肝纖維化大鼠肝組織ColⅠ、ColⅢ的情況，以二倍劑量效果最為明顯。通過降低JAK2蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路，可能是其發(fā)揮抗肝纖維化的作用機(jī)制之一。
　　 第二

8、部分:化濁解毒方調(diào)節(jié)PDGF、CTGF、MCP-1和IL-13抑制DMN致大鼠肝纖維化的作用研究
　　 目的:通過觀察以化濁解毒法組方對(duì)DMN致大鼠肝纖維化模型中肝組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-BB(PDGF-BB)、血清中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)和白細(xì)胞介素-13(IL-13)含量的影響，探討化濁解毒方經(jīng)細(xì)胞因子抗肝纖維化的作用和機(jī)制。
　　 方法:運(yùn)

9、用RT-PCR法檢測(cè)肝組織中PDGF-BBmRNA的表達(dá)，運(yùn)用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.化濁解毒方對(duì)大鼠肝組織PDGF-BBmRNA表達(dá)的影響:與A組比較，B組PDGF-BBmRNA的表達(dá)顯著增加(P＜0.01);與B組比較，C、D1組PDGF-BBmRNA表達(dá)均降低(P＜0.05);D2組的PDGF-BBmRNA降低更為顯著(P＜0.01);D3組與B組

10、PDGF-BBmRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);D3組PDGF-BBmRNA的表達(dá)較D2組顯著升高(P＜0.01)。
　　 2.化濁解毒方對(duì)大鼠血清中CTGF含量的影響:與A組相比，B組CTGF含量增多(P＜0.05);與B組相比，各給藥組大鼠血清CTGF含量均降低(P＜0.05);與C組相比，D3組含量有增多趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.063＞0.05);D2組CTGF含量較C組、D1、D3組均降低(P＜0.0

11、5)。
　　 3.化濁解毒方對(duì)大鼠血清中MCP-1含量的影響:與A組相比，B組MCP-1表達(dá)明顯增多(P＜0.01);與B相比，除D3組外(P＞0.05)，各治療組MCP-1含量均明顯降低(P＜0.01);C組MCP-1含量較D1、D3組降低(P＜0.01,P＜0.05)。
　　 4.化濁解毒方對(duì)大鼠血清中IL-13含量的影響:與A組相比，B組IL-13含量明顯增多(P＜0.01);與B組相比，各給藥組大鼠血清IL-13

12、含量均明顯降低(P＜0.01);C組IL-13含量較D3組顯著降低(P＜0.01);D2組IL-13含量與D1、D3組相比顯著降低(P＜0.01，P＜0.05)。
　　 結(jié)論:化濁解毒方可減少DMN致肝纖維化大鼠肝組織中PDGF-BB的表達(dá)及血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量，推測(cè)上述細(xì)胞因子是化濁解毒方抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。
　　 第三部分化濁解毒方含藥血清經(jīng)MAPK及PI3K/AKT通路抑制大鼠HSC活

13、化的作用研究
　　 目的:運(yùn)用血清藥理學(xué)方法觀察大鼠HSC中p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表達(dá)，評(píng)價(jià)化濁解毒方大鼠含藥血清對(duì)MAPK、PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，探討化濁解毒方抗肝纖維化可能的分子水平作用機(jī)制。
　　 方法:選取健康成年雄性SD大鼠，按分組要求灌胃給予相應(yīng)藥物10天后制備含藥血清，分為:正常對(duì)照組（A組）、模型對(duì)照組（B組）、陽性對(duì)照組（C組）、化濁解毒方含藥血清等效劑量(D1

14、)和二倍劑量(D2)組，B、C、D1、D2組均先行加入TGF-β1干預(yù)。各組加入相應(yīng)血清培養(yǎng)48h后，利用Western-blot法檢測(cè)p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.p-p38蛋白的表達(dá):與A組比較，B組p-p38蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05);與B組比較，各給藥組p-p38蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05);與C組比較，D1組p-p38蛋白表達(dá)有增高趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)

15、計(jì)學(xué)意義(P=0.051＞0.05)，D2組較C組及D1組p-p38蛋白表達(dá)均降低(P＜0.05)。
　　 2.p-JNK蛋白的表達(dá):與A組比較，B組p-JNK蛋白的表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.05);與B組比較，各給藥組p-JNK蛋白的表達(dá)降低(P＜0.05)。與C組比較，D1、D2組p-JNK蛋白的表達(dá)均降低(P＜0.05);D2組p-JNK蛋白的表達(dá)低于D1組(P＜0.05)。
　　 3.PI3K蛋白的表達(dá):與A組比較，各受

16、試組PI3K蛋白表達(dá)均升高(P＜0.05);與B組比較，D2組PI3K蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01);D2組PI3K蛋白表達(dá)低于C組和D1組(P＜0.05)。
　　 4.p-AKT蛋白的表達(dá):與A組比較，各受試組p-AKT蛋白的表達(dá)升高(P＜0.05);各給藥組p-AKT蛋白表達(dá)均較B組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中D2組差異有顯著性(P＜0.01);D2與D1組比較，p-AKT蛋白表達(dá)降低，(P＜0.05)。<