JN219抗輪狀病毒機理研究模型的建立.pdf

1、本實驗室發(fā)現(xiàn)一株真菌菌絲的代謝產(chǎn)物具有抗病毒活性，用硅膠柱層析和制備型高效液相色譜得到了具有抗病毒活性的純品，命名為JN219。JN219極性較強，在220nm有最大的紫外吸收峰，質(zhì)譜(ESI)測得該化合物分子量為519道爾頓。體外抗病毒活性跟蹤發(fā)現(xiàn)JN219具有抗輪狀病毒(RV)活性，在μg-ng/ml水平可使1000個TCID50/ml的HCMV、VSV、RV完全喪失感染活力；體內(nèi)療效模型研究發(fā)現(xiàn)，JN219可以緩解RV(SA11株

2、)感染引起的乳鼠腹瀉。初步表明JN219不僅僅在體外有顯著抑毒效果，而且體內(nèi)效果顯著。明確抗病毒機制是藥物應用臨床的先決條件之一。為研究JN219的抗RV機制，本研究小組進行了初步的探索，發(fā)現(xiàn)JN219可能是作用于病毒復制周期最初黏附.融合.穿入階段，通過阻止病毒進入宿主細胞實現(xiàn)抗病毒作用，那么JN219在RV穿入細胞過程中，如何阻斷病毒穿入發(fā)揮抗病毒效果的?本研究采用原核載體克隆表達輪狀病毒外殼蛋白VP4及其亞單位VP5*、VP8*，

3、用體外細胞培養(yǎng)病毒感染模型競爭抑制試驗建立抗RV機理研究模型，為探討JN219抑制RV穿入宿主細胞的分子靶位、明確JN219抑制病毒穿入宿主細胞機理奠定基礎(chǔ)。 目的：建立研究JN219阻止RV穿入細胞的研究模型，為探討JN219抑制RV穿入機理奠定基礎(chǔ)。 方法： 1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克隆表達和純化 (1)構(gòu)建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP

4、8*表達載體 在GeneBank查得RVVP4全基因序列，以RV之細胞培養(yǎng)物作為模板用RT-PCR方法擴增目的基因，與pET30a載體連接后轉(zhuǎn)化BL21(plysS)，用PCR、酶切方法鑒定后挑選陽性菌落委托測序。 (2)誘導表達、純化目的蛋白 將陽性菌落擴增、提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(plysS)菌株，用IPTG誘導、SDS-PAGE方法檢追蹤研究表達條件、用鎳柱層析純化目的蛋白(6×his標簽)。用標簽抗體-We

5、sternblot方法進行鑒定。 2.JN219抑制RV穿入過程研究模型的建立 (1)純化蛋白毒性研究 將VP4、VP5*、VP8*梯度稀釋后接種MA104細胞，與細胞對照比較，通過細胞病變觀察重組蛋白的細胞毒性。 (2)JN219抑制RV細胞穿入現(xiàn)象的確定 a)病毒接種細胞1h，病毒完成穿入過程后接種JN219到多孔板細胞上，根據(jù)細胞病變判斷JN219作用效果。若不出現(xiàn)病毒病變，可表明JN219

6、具有抑制病毒基因轉(zhuǎn)錄復制的作用。 b)將JN219與病毒作用1h后接種于細胞，根據(jù)細胞病變判斷JN219抗病毒活性；若不出現(xiàn)病毒病變，說明JN219在病毒穿入細胞前發(fā)揮抗病毒作用，抑制了病毒的穿入過程。 c)將紫外線滅活的病毒與JN219作用后，將混合液與病毒作用1h接種細胞，觀察滅活的病毒是否競爭了JN219的抗病毒穿入位點，來探討JN219是否通過作用于病毒外殼融合蛋白而實現(xiàn)抑制病毒的機制。 (3)JN219

7、阻止RV穿入過程分子機制研究模型的建立(競爭結(jié)合試驗) 上述試驗發(fā)現(xiàn)，JN219作用于病毒復制周期最初黏附-融合-穿入階段，通過阻止病毒進入宿主細胞實現(xiàn)抗病毒作用。如果將JN219與VP4、VP5*、VP8*作用(與JN219的抗病毒穿入位點結(jié)合)，則JN219在后續(xù)的抗病毒試驗過程中可能喪失抗病毒活性，通過該模型，可明確JN219抑制RV穿入過程的分子靶位。 結(jié)果： 1.RV膜蛋白VP4、VP5*、VP8*的克

8、隆表達和純化 (1)構(gòu)建pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*表達載體 經(jīng)PCR和酶切鑒定證實構(gòu)建的pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*質(zhì)粒目的基因分子量與預測分子量均一致，通過GeneBank序列比對，pET30a(+)VP4質(zhì)粒前780bp處有5個堿基發(fā)生突變，后870bp處有2個堿基發(fā)生突變，經(jīng)蛋白分析軟件分析認為不影響其功能。

9、 (2)誘導表達、純化目的蛋白 pET30a(+)VP4、pET30a(+)VP5*、pET30a(+)VP8*的BL21(plysS)菌株用IPTG誘導、經(jīng)His-鎳柱層析純化了目的蛋白，VP4、VP5*、VP8*三個蛋白的純度均達到90％，VP4為0.24μg/ml、VP5*為0.8μg/ml、VP8*為0.5μg/ml。它們均與標簽抗體發(fā)生反應(Westernblot)。 2.JN219抑制RV穿入過程研究模

10、型的建立 (1)純化蛋白毒性研究：將VP4、VP5*、VP8*梯度稀釋后接種MA104細胞，與細胞對照比較，未發(fā)現(xiàn)細胞病變發(fā)生。 (2)JN219抑制RV細胞穿入現(xiàn)象的確定 a)病毒接種細胞1h、病毒完成穿入過程后用JN219攻擊，與病毒對照組相比實驗組細胞病變率低，表明JN219對病毒基因復制轉(zhuǎn)錄表達有抑制作用。 b)將JN219與病毒作用1h后接種細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實驗組細胞形態(tài)基本正常，表明病毒感染過程

11、被抑制，且JN219作用機制與病毒黏附、穿入過程相關(guān)。 c)JN219與紫外滅活病毒充分作用后，再與RV作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞出現(xiàn)RV病變，表明JN219的抗病毒活性被紫外滅活的病毒消耗，提示JN219可能是與病毒外殼上某種功能蛋白發(fā)生作用，干擾了病毒穿入過程。 (3)JN219阻止RV穿入過程分子機制研究模型的建立(競爭結(jié)合試驗)試驗 設計將JN219與VP4、VP5*、VP8*作用，通過JN219在后續(xù)的抗病毒試

12、驗過程中的細胞病變程度，判斷JN219抑制RV活性是否VP4、VP5*、VP8*所阻斷，經(jīng)過實驗初步明確JN219與VP4結(jié)合是其抗RV穿入機制之一。功能亞單位VP5*、VP8*是否是JN219作用位點有待后續(xù)研究確定。 結(jié)論： 1.采用原核細胞表達系統(tǒng)，獲得了RV外殼蛋白VP4及其酶切片段VP5*、VP8*，VP4、VP5*、VP8*純度在90％左右。 2.建立病毒感染模型，初步確定JN219與VP4結(jié)合后，其