豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原對(duì)NF-kB信號(hào)通路的影響.pdf

1、剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是由法國學(xué)者于1908年發(fā)現(xiàn)的能廣泛寄生于包括人在內(nèi)的所有溫血?jiǎng)游镉泻思?xì)胞內(nèi)的一種寄生蟲，它能引起嚴(yán)重的人畜共患弓形蟲病。人類對(duì)弓形蟲具有較強(qiáng)的自然免疫能力，免疫功能正常的成年人感染后多呈隱形感染，但是對(duì)于一些免疫功能受損、免疫缺陷者或者先天性弓形蟲感染者，往往會(huì)造成嚴(yán)重的后果，因而弓形蟲病的有效防治是極為重要的。弓形蟲生活史復(fù)雜，包括組織包囊、卵囊、配子體、速殖子和緩殖子等眾多發(fā)育形式，

2、此外在長期的寄生生活中，弓形蟲發(fā)展出很多的免疫逃避機(jī)制以逃避宿主的免疫攻擊。而弓形蟲在入侵的過程中，體內(nèi)誘導(dǎo)抗原會(huì)在宿主內(nèi)大量表達(dá)，推測可能是宿主的免疫系統(tǒng)釋放了免疫因子刺激其體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的表達(dá)。
　　哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族是B細(xì)胞中κB輕鏈的調(diào)控原件，也是動(dòng)物主動(dòng)免疫過程中關(guān)鍵性的調(diào)控因子。NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、分化以及存活都有著一定關(guān)聯(lián)，同時(shí)NF-κB信號(hào)通路還是宿主免疫系統(tǒng)調(diào)控的重要

3、手段。
　　因此體內(nèi)誘導(dǎo)抗原與NF-κB信號(hào)通路極可能有潛在的相互作用。本研究首先將實(shí)驗(yàn)室之前的同學(xué)已經(jīng)篩選獲得的豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原陽性結(jié)果中的部分抗原基因進(jìn)行體內(nèi)外表達(dá)差異的驗(yàn)證，PCR擴(kuò)增基因全長的ORF;然后利用雙熒光素酶檢測方法檢測了這些抗原對(duì)NF-κB信號(hào)通路的激活效應(yīng)，并在TNF-α刺激下檢測了它們對(duì)該信號(hào)通路的抑制效應(yīng)。具體工作包括以下幾個(gè)方面:
　　(1)豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原體內(nèi)外表達(dá)差異的驗(yàn)證及全長ORF

4、的PCR擴(kuò)增
　　選擇本實(shí)驗(yàn)室之前的同學(xué)篩選得到的14個(gè)豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原陽性克隆中的5個(gè)功能蛋白，即亮氨酸重復(fù)序列(LRL)、鈣調(diào)蛋白(CaM)、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(D3)、致密顆粒蛋白5(GRA5)、致密顆粒蛋白15(GRA15)，同時(shí)包括3個(gè)未知功能的假定蛋白，TOX.DB上的編號(hào)分別為TGGT1-098800（暫稱G1）、TGME49-212160(M4)、TGGT1-059670(JK)，根據(jù)各自的ORF設(shè)計(jì)引物

5、，real-timePCR檢測感染弓形蟲速殖子72個(gè)小時(shí)的BALB/c鼠中的蟲子和BHK細(xì)胞中培養(yǎng)相同時(shí)長的弓形蟲速殖子中這8個(gè)基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的差異。結(jié)果顯示，BALB/c鼠體內(nèi)速殖子內(nèi)這8個(gè)基因中有6個(gè)的表達(dá)量都顯著高于體外BHK中的表達(dá)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異顯著(P＜0.05)。另外LRL和M4體內(nèi)外表達(dá)差異并不明顯。利用數(shù)據(jù)庫中的基因全長CDS序列設(shè)計(jì)了真核表達(dá)引物，分別克隆這6個(gè)基因的ORF片段，連接真核表達(dá)載體pCMV-

6、tag2B，構(gòu)建了帶Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　(2)豬弓形蟲體內(nèi)外表達(dá)差異抗原對(duì)NF-κB信號(hào)通路激活效應(yīng)的影響
　　利用雙熒光素酶檢測方法，驗(yàn)證體內(nèi)誘導(dǎo)抗原對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響。利用已經(jīng)構(gòu)建好的NF-κB轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動(dòng)子或3'UTR)克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，使之作為受調(diào)控的報(bào)告基因，再將海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對(duì)照，在細(xì)胞中同時(shí)轉(zhuǎn)染以上兩種質(zhì)粒，檢測NF-κB信號(hào)通路的激活。

7、以報(bào)道過的弓形蟲ME49株(typeⅡ型)的GRA15作為陽性對(duì)照，結(jié)果顯示，體內(nèi)誘導(dǎo)抗原RH株(typeⅠ型)GRA15有顯著的激活NF-κB信號(hào)通路的效應(yīng)。但是隨后的NF-κB原件p65的核轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)未能成功驗(yàn)證這一結(jié)果。
　　(3)豬弓形蟲體內(nèi)外表達(dá)差異抗原對(duì)NF-κB信號(hào)通路抑制效應(yīng)的影響
　　同樣利用雙熒光素酶檢測方法，以NF-κB信號(hào)通路的刺激物TNF-α的添加作為激活組，在同樣的刺激劑量和時(shí)間作用下，觀察載體組和

8、體內(nèi)誘導(dǎo)基因組對(duì)NF-κB信號(hào)通路抑制效應(yīng)的影響。通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，相比較載體組均未發(fā)現(xiàn)這些基因有抑制NF-κB信號(hào)通路的作用。
　　(4)致密顆粒蛋白GRA15(Ⅰ/Ⅱ)免疫原性的研究
　　typeⅠ型和Ⅱ型的GRA15都和免疫相關(guān)的NF-κB信號(hào)通路有一定關(guān)聯(lián)，我們利用小鼠模型求證了這兩個(gè)都能激活NF-κB信號(hào)通路的基因在BALB/c鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。三次免疫后檢測了弓形蟲全蟲裂解抗原刺激抗體產(chǎn)生水平、淋巴細(xì)胞增