

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)是由法國學(xué)者于1908年發(fā)現(xiàn)的能廣泛寄生于包括人在內(nèi)的所有溫血動物有核細胞內(nèi)的一種寄生蟲,它能引起嚴重的人畜共患弓形蟲病。人類對弓形蟲具有較強的自然免疫能力,免疫功能正常的成年人感染后多呈隱形感染,但是對于一些免疫功能受損、免疫缺陷者或者先天性弓形蟲感染者,往往會造成嚴重的后果,因而弓形蟲病的有效防治是極為重要的。弓形蟲生活史復(fù)雜,包括組織包囊、卵囊、配子體、速殖子和緩殖子等眾多發(fā)育形式,
2、此外在長期的寄生生活中,弓形蟲發(fā)展出很多的免疫逃避機制以逃避宿主的免疫攻擊。而弓形蟲在入侵的過程中,體內(nèi)誘導(dǎo)抗原會在宿主內(nèi)大量表達,推測可能是宿主的免疫系統(tǒng)釋放了免疫因子刺激其體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的表達。
哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子NF-κB家族是B細胞中κB輕鏈的調(diào)控原件,也是動物主動免疫過程中關(guān)鍵性的調(diào)控因子。NF-κB家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與炎性反應(yīng)、細胞凋亡、細胞增殖、分化以及存活都有著一定關(guān)聯(lián),同時NF-κB信號通路還是宿主免疫系統(tǒng)調(diào)控的重要
3、手段。
因此體內(nèi)誘導(dǎo)抗原與NF-κB信號通路極可能有潛在的相互作用。本研究首先將實驗室之前的同學(xué)已經(jīng)篩選獲得的豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原陽性結(jié)果中的部分抗原基因進行體內(nèi)外表達差異的驗證,PCR擴增基因全長的ORF;然后利用雙熒光素酶檢測方法檢測了這些抗原對NF-κB信號通路的激活效應(yīng),并在TNF-α刺激下檢測了它們對該信號通路的抑制效應(yīng)。具體工作包括以下幾個方面:
(1)豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原體內(nèi)外表達差異的驗證及全長ORF
4、的PCR擴增
選擇本實驗室之前的同學(xué)篩選得到的14個豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原陽性克隆中的5個功能蛋白,即亮氨酸重復(fù)序列(LRL)、鈣調(diào)蛋白(CaM)、D-3-磷酸甘油酸脫氫酶(D3)、致密顆粒蛋白5(GRA5)、致密顆粒蛋白15(GRA15),同時包括3個未知功能的假定蛋白,TOX.DB上的編號分別為TGGT1-098800(暫稱G1)、TGME49-212160(M4)、TGGT1-059670(JK),根據(jù)各自的ORF設(shè)計引物
5、,real-timePCR檢測感染弓形蟲速殖子72個小時的BALB/c鼠中的蟲子和BHK細胞中培養(yǎng)相同時長的弓形蟲速殖子中這8個基因mRNA相對表達水平的差異。結(jié)果顯示,BALB/c鼠體內(nèi)速殖子內(nèi)這8個基因中有6個的表達量都顯著高于體外BHK中的表達量,統(tǒng)計學(xué)分析差異顯著(P<0.05)。另外LRL和M4體內(nèi)外表達差異并不明顯。利用數(shù)據(jù)庫中的基因全長CDS序列設(shè)計了真核表達引物,分別克隆這6個基因的ORF片段,連接真核表達載體pCMV-
6、tag2B,構(gòu)建了帶Flag標簽的真核表達質(zhì)粒。
(2)豬弓形蟲體內(nèi)外表達差異抗原對NF-κB信號通路激活效應(yīng)的影響
利用雙熒光素酶檢測方法,驗證體內(nèi)誘導(dǎo)抗原對NF-κB信號通路的影響。利用已經(jīng)構(gòu)建好的NF-κB轉(zhuǎn)錄的調(diào)控元件(啟動子或3'UTR)克隆在螢火蟲熒光素酶基因的上游,構(gòu)建熒光素酶報告質(zhì)粒,使之作為受調(diào)控的報告基因,再將海腎熒光素酶基因作為內(nèi)對照,在細胞中同時轉(zhuǎn)染以上兩種質(zhì)粒,檢測NF-κB信號通路的激活。
7、以報道過的弓形蟲ME49株(typeⅡ型)的GRA15作為陽性對照,結(jié)果顯示,體內(nèi)誘導(dǎo)抗原RH株(typeⅠ型)GRA15有顯著的激活NF-κB信號通路的效應(yīng)。但是隨后的NF-κB原件p65的核轉(zhuǎn)移實驗未能成功驗證這一結(jié)果。
(3)豬弓形蟲體內(nèi)外表達差異抗原對NF-κB信號通路抑制效應(yīng)的影響
同樣利用雙熒光素酶檢測方法,以NF-κB信號通路的刺激物TNF-α的添加作為激活組,在同樣的刺激劑量和時間作用下,觀察載體組和
8、體內(nèi)誘導(dǎo)基因組對NF-κB信號通路抑制效應(yīng)的影響。通過多次重復(fù)實驗,相比較載體組均未發(fā)現(xiàn)這些基因有抑制NF-κB信號通路的作用。
(4)致密顆粒蛋白GRA15(Ⅰ/Ⅱ)免疫原性的研究
typeⅠ型和Ⅱ型的GRA15都和免疫相關(guān)的NF-κB信號通路有一定關(guān)聯(lián),我們利用小鼠模型求證了這兩個都能激活NF-κB信號通路的基因在BALB/c鼠體內(nèi)誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力。三次免疫后檢測了弓形蟲全蟲裂解抗原刺激抗體產(chǎn)生水平、淋巴細胞增
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 豬弓形蟲體內(nèi)誘導(dǎo)抗原的鑒定及功能分析.pdf
- nf-kb信號通路
- 弓形蟲抗原調(diào)節(jié)NF-κB信號通路的機制研究.pdf
- IKZF1基因?qū)F-KB信號通路影響的初步研究.pdf
- 靶向siRNA阻斷NF-kB信號通路對神經(jīng)母細胞瘤侵襲轉(zhuǎn)移的影響.pdf
- 干預(yù)NF-kB信號通路對新生大鼠大腦皮層神經(jīng)元死亡的影響.pdf
- rAAV9介導(dǎo)抗NF-kB核酶基因體外轉(zhuǎn)染心肌細胞及對NF-kB活性影響的研究.pdf
- 雷公藤多苷誘導(dǎo)大鼠腎細胞凋亡的NF-kB信號傳導(dǎo)通路機制研究.pdf
- 弓形蟲C-18、MIC11、PI等體內(nèi)外差異表達基因?qū)F-κB信號通路的影響.pdf
- 轉(zhuǎn)錄因子NF-kB信號通路在胰島炎發(fā)生中的機制研究.pdf
- NF-kB信號通路在RU486誘導(dǎo)小鼠月經(jīng)模型月經(jīng)發(fā)生早期過程中的作用.pdf
- 芍藥苷對膽紅素誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及NF-kB活性的影響.pdf
- HPD、NLK調(diào)控NF-kB通路和TGFβ通路及機制研究.pdf
- NEMO在T細胞受體介導(dǎo)的NF-kB信號通路中的抑制作用.pdf
- 弓形蟲排泄分泌抗原(ESA)通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞凋亡.pdf
- 白三烯B4炎性通路中EMMPRIN基因沉默對NF-kB的影響.pdf
- 舒林酸對結(jié)腸癌細胞NF-kB信號通路的干預(yù)作用及機制探討.pdf
- LPS誘導(dǎo)人蛻膜細胞中NF-KB表達的研究.pdf
- 參芪復(fù)方對gk大鼠腎臟nf-kb及ppary影響
- 參芪復(fù)方對GK大鼠腎臟NF-KB及PPARY的影響.pdf
評論
0/150
提交評論