慢病毒介導(dǎo)的LDH-AsiRNA通過下調(diào)Oct4抑制腸型胃癌的腫瘤形成.pdf

1、十九世紀三十年代，Warburg發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細胞即使在有氧的情況下也進行糖酵解，即“Warburg效應(yīng)”，而正常細胞主要通過線粒體的氧化磷酸化來獲得能量。盡管很長一段時間人們一直致力于研究導(dǎo)致腫瘤發(fā)生發(fā)展的基因突變，而忽略了腫瘤能量代謝的研究，而近來的研究表明Warburg效應(yīng)在許多腫瘤中起著重要的作用，特別是用以監(jiān)測惡性腫瘤的PET-CT在臨床的廣泛應(yīng)用更加說明了這一點。LDH-A(LactatedehydrogenaseA)是把丙酮

2、酸轉(zhuǎn)化為乳酸的代謝酶，是糖酵解的關(guān)鍵酶。已有研究表明在惡性淋巴瘤和乳腺癌中LDH-A的抑制通過誘導(dǎo)氧自由基，增加線粒體途徑的凋亡來抑制腫瘤形成。HIF1α對維持正常干細胞和腫瘤干細胞功能有重要作用，而LDH-A作為HIF1α的下游分子，是否對腫瘤干細胞的自我更新和多能性有作用?如果有作用，又通過怎樣的作用機制?目前國內(nèi)外尚未有LDH-A與腫瘤干細胞相關(guān)基因關(guān)系的報道。本研究通過慢病毒介導(dǎo)的LDH-AsiRNA轉(zhuǎn)染SGC7901細胞株，研

3、究LDH-A下調(diào)后干性基因Yamanaka因子的表達變化，從干細胞角度探討LDH-A沉默對腸型胃癌腫瘤形成的影響及其作用機制。
　　 第一部分，LDH-A在腸型胃癌和胃癌細胞系的表達情況研究
　　 目的：
　　 研究LDH-A在人腸型胃癌組織和胃癌細胞株中的表達情況；LDH-A表達與臨床病理參數(shù)、Oct4表達的相關(guān)性；生存分析進一步研究LDH-A與Oct4在腸型胃癌發(fā)展中是否有協(xié)同作用。
　　 方法：

4、r>　　 采用Westernblot方法檢測永生化人胃黏膜上皮細胞株GES和胃癌細胞株AGS，MKN28，MKN45，SGC7901，BGC823，SNU-1中LDH-A的表達。對661例臨床資料完整的腸型胃癌及其對應(yīng)癌旁正常胃組織標本采用免疫組化方法檢測LDH-A在組織學(xué)水平的表達，結(jié)合臨床病理資料對實驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析，對有超過5年隨訪資料的417例患者進行生存分析。終末隨訪時間2010年3月。
　　 結(jié)果：
　　

5、 1.Westernblot結(jié)果顯示：和GES相比，LDH-A在胃腸型腺癌細胞株SGC7901，BGC823與AGS中的表達明顯上調(diào)；LDH-A在胃腸型腺癌的高表達率明顯高于癌旁正常組織(P<0.0001)。
　　 2.在腸型胃癌組織中，LDH-A的高表達與腫瘤大小、浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.0001)相關(guān)。LDH-A在腸型胃癌中的表達與Oct4(P=0.01)和Ki67(P=0.003)呈正相關(guān)。
　　 3.單

6、因素分析顯示：高表達LDH-A的患者預(yù)后較低表達LDH-A的患者差；高LDH-A/Oct4陽性表達較其它組合類型預(yù)后差。
　　 4.多因素分析顯示：LDH-A表達、浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移(P<0.0001)、腫瘤大小(P=0.002)以及Oct4(P=0.038)是判斷腸型胃癌預(yù)后獨立的預(yù)后因子。
　　 結(jié)論：
　　 LDH-A在腸型胃癌中上調(diào)，LDH-A高表達與Oct4陽性表達呈正相關(guān)，兩者的聯(lián)合表

7、達預(yù)后較差，提示LDH-A在信號通路中可能位于Oct4的上游，調(diào)節(jié)Oct4的表達，但不能排除兩者之間的平行關(guān)系。需要”knockinand/orknockout”實驗加以進一步驗證前者排除后者。
　　 第二部分，體內(nèi)體外實驗證實：LeshLDH-A通過下調(diào)Oct4抑制腸型胃癌腫瘤形成
　　 目的：
　　 構(gòu)建LDH-A干擾序列siRNA376，siRNA506，siRNA980瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞株，篩選出

8、干擾效果最佳的序列，在RNA水平上檢測LDH-A干擾后的Yamanaka因子及相關(guān)基因的表達變化；把干擾效果最佳的序列進行慢病毒包裝，用以穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細胞株，在mRNA和蛋白水平驗證瞬時轉(zhuǎn)染后相關(guān)基因變化的結(jié)果，并在裸鼠體內(nèi)進一步驗證體外實驗結(jié)果。
　　 方法：
　　 1.采用Westernblot和Real-timeRT-PCR方法在三個LDH-A干擾序列篩選出對LDH-A干擾效果最佳者。
　　 2.在篩

9、選出來的干擾序列瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞72小時，提取RNA，采用Real-timeRT-PCR方法檢測Yamanaka因子及相關(guān)基因的表達變化情況。
　　 3.在瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果的基礎(chǔ)上，對篩選出的干擾序列進行慢病毒包裝(LeshLDH-A)，進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，進一步驗證瞬時轉(zhuǎn)染Real-timeRT-PCR結(jié)果。對于有明顯變化的基因用Wsternblot方法檢測其蛋白水平的表達情況。
　　 4.用克隆形成

10、和MTT實驗檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細胞的細胞增殖；流式細胞儀檢測其凋亡；劃痕實驗檢測轉(zhuǎn)染后細胞遷徙能力的變化。
　　 5.建立SGC7901細胞荷瘤鼠模型，觀察比較干擾組和對照組腫瘤生長情況和終端重量，通過對腫瘤組織進行免疫組化檢測相關(guān)基因的蛋白表達，以期了解與體外實驗是否相符。
　　 結(jié)果：
　　 1.Westernblot和Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示siRNA376干擾效果最佳。
　　

11、 2.體外用siRNA376瞬時轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，Real-timeRT-PCR結(jié)果顯示LDH-A沉默顯著下調(diào)Yamanaka因子(Oct4，Sox2，Klf4，c-Myc)中的關(guān)鍵基因：Oct4和Sox2，并中度下調(diào)HDAC1的表達。siRNA376慢病毒包裝后穩(wěn)定轉(zhuǎn)染SGC7901細胞，采用Real-timeRT-PCR和Westernblot方法分別在mRNA和蛋白水平驗證了瞬時轉(zhuǎn)染結(jié)果。
　　 3.LeshLDH-

12、A明顯降低SGC7901細胞的克隆形成和增殖能力，并顯著增加細胞的凋亡，降低遷徙能力。4.LeshLDH-A組小鼠腫瘤的生長速率和終端重量明顯低于對照組，免疫組化結(jié)果顯示LeshLDH-A組小鼠的Oct4和Ki67的表達顯著低于對照組。與體外實驗結(jié)果相符。
　　 結(jié)論：
　　 體內(nèi)體外結(jié)果顯示：LDH-A的沉默顯著下調(diào)Oct4的表達，Oct4可能是LDH-A直接的下游分子。LDH-A和Oct4的密切關(guān)系為臨床上高表達LD