產(chǎn)黑色素卟啉單胞菌誘導(dǎo)骨吸收作用機(jī)制的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)通過研究P.g、P.e對(duì)成骨細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、細(xì)胞的活性及增殖能力、表達(dá)前炎癥因子MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)以及骨代謝的最終調(diào)節(jié)因子OPG(osteoprotegerin)、RANKL(receptor activator 實(shí)驗(yàn)結(jié)果: 1.P.g、P.e標(biāo)準(zhǔn)菌株的復(fù)蘇培養(yǎng)及鑒定厭氧血瓊脂固體培養(yǎng)基培養(yǎng)4d的P.g、P.e的菌落均為圓形、直徑2-3mm、凸起、有光

2、澤、表面光滑邊緣整齊的黑色菌落，與血瓊脂表面附著力較強(qiáng)，革蘭氏染色陰性，光學(xué)顯微鏡下見細(xì)菌為紅色1-3μm大小的短球桿菌，無芽胞。 2.原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下可見，由大鼠頭蓋骨消化下來的成骨細(xì)胞為小圓形，散在懸浮于細(xì)胞培養(yǎng)液中。培養(yǎng)24h后，活細(xì)胞開始貼壁生長(zhǎng)，死細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞呈梭形或多邊形，可有數(shù)個(gè)細(xì)胞突起，培養(yǎng)6d左右基本長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶壁，成骨細(xì)胞在單層鋪滿培養(yǎng)瓶后可出現(xiàn)重疊生長(zhǎng)。

3、傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長(zhǎng)較快，一般在接種后2h即已貼壁，培養(yǎng)3d細(xì)胞可長(zhǎng)滿瓶壁，細(xì)胞形態(tài)與原代培養(yǎng)相同。 3.大鼠成骨細(xì)胞的鑒定蓋玻片培養(yǎng)的成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原免疫組化染色可見：多角形細(xì)胞的胞漿內(nèi)有豐富的棕色陽性染色顆粒，為成骨細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原，細(xì)胞核呈圓形蘭色深染，為蘇木素復(fù)染色結(jié)果。 4.P.g、P.e感染成骨細(xì)胞后細(xì)胞增殖率的變化AlamarBlueTM攝人法測(cè)定細(xì)菌感染前后，成骨細(xì)胞增殖率的變化結(jié)果可見：正常大鼠成骨細(xì)胞

4、的增殖率為37.26，當(dāng)以濃度為105-109CFU/ml的P.g、P.e感染細(xì)胞后，細(xì)胞增殖率下降，并且隨著細(xì)菌濃度的增加，增殖率下降更加明顯。當(dāng)細(xì)菌濃度達(dá)到107CFU/ml時(shí)，細(xì)胞增殖率與對(duì)照組相比有顯著性差異(P＜0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.P.g、P.e感染成骨細(xì)胞后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化正常大鼠成骨細(xì)胞表面有多個(gè)微絨毛突起，細(xì)胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富，細(xì)胞核呈圓形或卵圓形，偏位存在于胞漿內(nèi)，核染色質(zhì)分布均勻

5、，可見核仁。被P.g、P.e感染的成骨細(xì)胞，表面突起增多，細(xì)胞核形態(tài)變異較大成不規(guī)則狀，可有多個(gè)細(xì)胞核切跡，核染色質(zhì)凝集成塊邊集排列，核仁溶解消失，細(xì)胞漿內(nèi)大量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張成池，并可見髓樣小體等病理性改變。 6.P.g、P.e感染成骨細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞表達(dá)OPG、RANKLmRNA的影響P.g、P.e兩種產(chǎn)黑色素菌都能影響大鼠成骨細(xì)胞OPG、RANKLmRNA的表達(dá)，并且其作用具有濃度依賴性，RT-PCR擴(kuò)增及凝膠電泳成像分析結(jié)果提

6、示：107、109CFU/mlP.g、P.e感染成骨細(xì)胞24h后，成骨細(xì)胞表達(dá)RANKLmRNA的水平都明顯高于對(duì)照組。109CFU/ml比107CFU/mlP.g、P.e的誘導(dǎo)作用更加明顯，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。動(dòng)力學(xué)觀察表明P.g、P.e感染后細(xì)胞表達(dá)OPG、RANKLnRNA都發(fā)生明顯改變。大鼠成骨細(xì)胞基礎(chǔ)表達(dá)OPGmRNA較明顯，P.g、P.e對(duì)其具有抑制作用而且抑制作用也具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，相反P.g、P.e能以濃度

7、和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)RANKLmRNA的表達(dá)，使OPG/RANKLmRNA比例倒置。 7.P.g、P.e感染成骨細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞分泌MCP-1蛋白的影響大鼠成骨細(xì)胞基礎(chǔ)分泌少量MCP-1，以106、108CFU/mL的P.g、P.e感染細(xì)胞后可增強(qiáng)細(xì)胞MCP-1蛋白的分泌。隨著細(xì)菌濃度的增加，細(xì)胞表達(dá)MCP-1增強(qiáng)。以108CFU/mlP.g、P.e感染細(xì)胞6h蛋白分泌開始增多，保持到24h達(dá)高峰，48h時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。