整體調(diào)控子PhoP直接調(diào)控鼠疫耶爾森氏菌胞內(nèi)生存能力的研究.pdf

1、鼠疫是一種古老的自然疫源性疾病，是由鼠疫耶爾森氏菌(以下簡稱鼠疫菌)引起的。機(jī)體感染早期，鼠疫菌能在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活并繁殖，是鼠疫菌致病的關(guān)鍵階段。PhoP-PhoQ是一種二元調(diào)控系統(tǒng)，它可以調(diào)控細(xì)菌的毒力，參與細(xì)菌對Mg2+限制性生長環(huán)境的適應(yīng)，而且還可以調(diào)節(jié)幾種革蘭氏陰性細(xì)菌的許多細(xì)胞活性。研究發(fā)現(xiàn)△phoP突變株對小鼠J774巨噬細(xì)胞感染力下降，對巨噬細(xì)胞殺(抑)菌機(jī)制(酸脅迫、過氧化氫刺激、高滲脅迫、抗菌肽作用)敏感性大大增強(qiáng)。雖

2、然毒力和生化表型實驗證明了PhoP-PhoQ控制著鼠疫菌胞內(nèi)寄生能力，但是PhoP-PhoQ如何控制這個過程的機(jī)制至今尚未闡明。 本研究首先利用基于Red系統(tǒng)的一步法突變技術(shù)缺失替換鼠疫菌的phoP基因，進(jìn)而利用鼠疫菌全基因組DNA芯片進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究。通過比較△phoP突變株和野生株在低鎂條件下的轉(zhuǎn)錄水平差異，界定表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的基因，這些基因組成了PhoP調(diào)控元，這一分析可從全基因組水平篩選出所有受PhoP-PhoQ直接

3、或間接調(diào)控的靶基因。然后，利用經(jīng)典分子生化實驗和生物信息學(xué)分析，深入探究二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP-PhoQ轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機(jī)制。 用凝膠遷移實驗明確46個操縱子/基因直接受PhoP的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。這些基因有的受PhoP的上調(diào)，有的受其下調(diào)，包括PhoP調(diào)控的各方面功能的基因。PhoP正調(diào)控mgtCB，后者可以調(diào)節(jié)Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)；通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激基因、分子伴侶和ATP-依賴性蛋白酶基因以及其他應(yīng)激基因來參與菌體的應(yīng)激防御機(jī)制；通過正調(diào)控gl

4、gPACXB操縱子來參與恢復(fù)高滲條件下細(xì)胞漿的體積、正調(diào)控pmrHFIJKLM和ugd基因來實現(xiàn)脂質(zhì)A的氨基阿拉伯糖修飾、調(diào)控代謝相關(guān)基因來參與鼠疫菌能量代謝、大分子和小分子的降解以及氨基酸、嘌呤、嘧啶、核苷酸、輔基和脂肪酸生物合成等。值得注意的是，鼠疫菌的PhoP能對包括其自身在內(nèi)的八個調(diào)節(jié)基因，phoP、crp、lacI、phoB、cyaA、ntrB、slyA和glnK，進(jìn)行直接調(diào)控從而發(fā)揮更大的級聯(lián)作用。因此，二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP

5、-PhoQ應(yīng)當(dāng)是鼠疫菌的一個整體調(diào)控子。 為了明確PhoP的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，本研究對26個凝膠遷移實驗陽性的基因的啟動子進(jìn)行了足跡實驗，得到了25個PhoP結(jié)合保護(hù)區(qū)域，在這個區(qū)域內(nèi)存在著PhoPbox，PhoP蛋白調(diào)控靶基因主要是通過結(jié)合各靶基因啟動子內(nèi)的PhoPbox，調(diào)控各基因的轉(zhuǎn)錄。用motifsampler軟件對這25個結(jié)合保護(hù)區(qū)域進(jìn)行同源比對，并從統(tǒng)計學(xué)角度分析了18個位置上的堿基分布情況，最終將鼠疫菌的PhoPbox

6、歸納為(T/G)(A/G)TTTA(A/T)七核苷酸同向重復(fù)序列。但PhoPbox存在著多種形式，根據(jù)串聯(lián)重復(fù)序列的基序拷貝數(shù)和是否含有-35序列，將啟動子結(jié)構(gòu)特征歸納為六種表現(xiàn)形式。 PhoP-PhoQ調(diào)控鼠疫菌的胞內(nèi)寄生能力，在巨噬細(xì)胞的吞噬溶酶體內(nèi)PhoP-PhoQ能夠感應(yīng)細(xì)胞內(nèi)低鎂環(huán)境，誘導(dǎo)有利于胞內(nèi)存活的基因轉(zhuǎn)錄。本研究通過比較轉(zhuǎn)錄組和經(jīng)典的分子生化實驗初步證明了鼠疫菌抵抗巨噬細(xì)胞的殺/抑菌機(jī)制：PhoP激活mgtCB

7、基因的表達(dá)，通過mgtB轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)調(diào)控的Mg2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持菌體的鎂環(huán)境自穩(wěn)態(tài)，最終保證鼠疫菌的正常生理活動需要；激活解毒酶基因、分子伴侶和ATP-依賴性蛋白酶基因、DNA結(jié)合蛋白基因以及一些通用蛋白基因的表達(dá)，代謝大量的02和H202，并抵抗低pH環(huán)境，保護(hù)蛋白和DNA免受損傷；通過激活脂質(zhì)A修飾酶基因的表達(dá)將氨基阿拉伯糖添加至脂質(zhì)A的磷酸基團(tuán)上，干擾抗菌肽與磷酸基團(tuán)的結(jié)合。 本研究首次在鼠疫菌中確定了二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP-Ph