Mitofusin2基因抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞A7r5增殖的研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞（vascularsmoothmusclecell，VSMC）異常增殖在血管增生性疾病中扮演著十分重要的角色，是動脈粥樣硬化形成、高血壓、冠心病、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)后再狹窄的病理基礎(chǔ)。細(xì)胞生長因子、炎癥因子、血流動力學(xué)異常等通過相關(guān)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，特別是通過激活Ras原癌基因及其所介導(dǎo)的Ras-Raf-MAPK和Ras-PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑，引起VSMC過度增殖。因此,阻擾這些路徑,抑制細(xì)胞異常增殖，

2、是防治血管增生性疾病的有效途徑。線粒體融合蛋白2(mitofusin2,Mfn2)基因是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的增殖抑制基因，它不僅抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，并且參與線粒體的融合、調(diào)節(jié)線粒體的新陳代謝、維持線粒體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。在高血壓大鼠和球囊損傷后再狹窄大鼠主動脈VSMC中Mfn2的表達(dá)均下降，因此上調(diào)Mfn2的表達(dá)可能會抑制該病理過程。本研究擬應(yīng)用基因克隆和基因重組等方法，觀察外源性Mfn2基因?qū)7r5細(xì)胞增殖的影響，并對其分子機(jī)制進(jìn)行

3、探討，以期為mfn2成為血管增殖性疾病的治療靶點提供實驗依據(jù)。
　　方法：通過RT-PCR獲得大鼠Mfn2CDS序列的cDNA，擴(kuò)增、純化、回收Mfn2基因片段并與載體pGEM-T連接成重組克隆載體pGEM-T-mfn2，轉(zhuǎn)化入E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞大量擴(kuò)增并行氨芐青霉素篩選。用HindⅢ和BamHⅠ雙酶切擴(kuò)增的大鼠Mfn2基因片段和質(zhì)粒pEGFP-N1，再將回收的pEGFP-N1大片段與Mfn2基因片段重組，轉(zhuǎn)化感受態(tài)D

4、H5α。采用質(zhì)粒小提產(chǎn)物PCR、HindⅢ和BamHⅠ雙酶切和序列分析方法，確定目標(biāo)片段的存在和序列正確性。將測序正確的重組質(zhì)粒pEGFP-mfn2在陽離子脂質(zhì)體的介導(dǎo)下體外轉(zhuǎn)染A7r5細(xì)胞，將細(xì)胞分成三組：空白對照組A7r5（未轉(zhuǎn)染組），空載體對照組（pEGFP-N1組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒），實驗組（A7r5-Mfn2-GFP組，轉(zhuǎn)染pEGFP-mfn2）。24h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（greenfluorescenceprotei

5、n,GFP）表達(dá)情況，分別于轉(zhuǎn)染后48h收獲三組細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR、Westernblot方法檢測Mfn2在A7r5細(xì)胞的表達(dá)情況。轉(zhuǎn)染成功且效率穩(wěn)定后，通過細(xì)胞計數(shù)法、MTS法檢測Mfn2對A7r5增殖的影響。流式細(xì)胞術(shù)分析外源性Mfn2基因在體外對A7r5細(xì)胞周期分布的影響。Westernblot檢測三組細(xì)胞的磷酸化Raf、磷酸化ERK1/2和磷酸化AKT蛋白表達(dá)的變化，采用方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
　　結(jié)果：從A7r

6、5細(xì)胞總RNA中經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增出一條約2.2kb的片段。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α后，通過抗性基因篩選出陽性克隆。質(zhì)粒小提產(chǎn)物PCR顯示存在2.2kb的特異性條帶；酶切結(jié)果顯示重組質(zhì)粒被切成4.7kb大小的pEGFP-N1載體和2.2kb大小的目的片段；經(jīng)測序，目的片段的序列與GeneBank中大鼠Mfn2基因的編碼序列完全一致；進(jìn)一步證實成功地構(gòu)建了含大鼠Mfn2基因的重組真核表達(dá)載體。熒光顯微鏡下觀察,轉(zhuǎn)染成功的A7r5細(xì)胞中有

7、GFP表達(dá),發(fā)出特異性的熒光。按轉(zhuǎn)染率=暗視野所見發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/明視野所見細(xì)胞總數(shù)×100％,計算轉(zhuǎn)染率為70%。RT-PCR及Westernblot證實轉(zhuǎn)染pEGFP-mfn2組的A7r5細(xì)胞中Mfn2mRNA和蛋白表達(dá)較對照兩組高。細(xì)胞計數(shù)法、MTS法檢測轉(zhuǎn)染pEGFP-mfn2組細(xì)胞數(shù)明顯低于空白對照組和空載體對照組（P＜0.05）,而對照兩組細(xì)胞數(shù)無明顯差異。轉(zhuǎn)染后48h流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明實驗組中多數(shù)VSMC停滯于GI

8、期，細(xì)胞比例為61.733±3.755，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=109.8，P＜0.05），兩對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Westernblot結(jié)果顯示：實驗組細(xì)胞與兩對照組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染后48h磷酸化c-Raf(p-c-Raf)，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)和磷酸化AKT（p-AKT）的表達(dá)水平明顯降低，其差異有顯著性(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.Mfn2基因過表達(dá)可以明顯抑制A7r5細(xì)胞的增