時(shí)鐘基因在母雞生殖系統(tǒng)中的節(jié)律性表達(dá)及顆粒細(xì)胞中時(shí)控基因的篩選.pdf

1、晝夜節(jié)律幾乎影響了生物體生命活動(dòng)的方方面面，幫助其趨利避害，實(shí)現(xiàn)和外界環(huán)境的同步和適應(yīng)，是生命的基本特征之一。雌禽的排卵-產(chǎn)蛋循環(huán)便具有明顯的節(jié)律性和環(huán)境適應(yīng)性，具體表現(xiàn)在排卵（產(chǎn)蛋）時(shí)間偏好、連產(chǎn)間歇等方面。時(shí)間生物學(xué)和生殖內(nèi)分泌學(xué)的發(fā)展為解釋上述現(xiàn)象提供了理論基礎(chǔ)，但性腺軸上的調(diào)控復(fù)雜交錯(cuò)，卵泡的成熟，排卵和蛋的形成是多組織、多過程、多層次參與的生理事件，其間不同生理進(jìn)程在時(shí)間上的吻合顯示了機(jī)體自身的協(xié)調(diào)統(tǒng)一。
　　單獨(dú)研究神

2、經(jīng)內(nèi)分泌或卵泡的發(fā)育無法全面的解釋排卵-產(chǎn)蛋這一復(fù)雜又特殊的生理過程，本研究從晝夜生物鐘系統(tǒng)切入，整合各過程的時(shí)間控制因素，解析排卵-產(chǎn)蛋中的節(jié)律現(xiàn)象。
　　1.產(chǎn)蛋監(jiān)測與產(chǎn)蛋規(guī)律分析
　　本研究通過記錄母雞在特定時(shí)間段里的具體產(chǎn)蛋時(shí)間，得到了商品蛋雞羅曼粉殼蛋雞在常規(guī)飼養(yǎng)條件下的產(chǎn)蛋性狀，包括:產(chǎn)蛋時(shí)間分布、連產(chǎn)間歇、間歇前一天產(chǎn)蛋時(shí)間分布和產(chǎn)蛋間隔時(shí)間。結(jié)果發(fā)現(xiàn):母雞產(chǎn)蛋有極強(qiáng)的時(shí)間偏好性，主要集中在8:00-12:00

3、這個(gè)時(shí)段;產(chǎn)蛋性能好的母雞產(chǎn)蛋時(shí)間間隔以24小時(shí)為軸心左右波動(dòng)。連產(chǎn)間歇前一天的產(chǎn)蛋時(shí)間在早、晚兩個(gè)時(shí)段密集分布，說明接近開放期的前后邊緣都會(huì)造成產(chǎn)蛋間歇。證實(shí)了產(chǎn)蛋開放期模型。
　　通過產(chǎn)蛋規(guī)律的監(jiān)測，挑選出了生理狀態(tài)一致（產(chǎn)蛋時(shí)間和產(chǎn)蛋周期一致）的雞群作為后續(xù)的試驗(yàn)材料。
　　2.時(shí)鐘基因的節(jié)律性表達(dá)與發(fā)條機(jī)制的定位
　　本研究通過檢測時(shí)鐘基因(Bmal1，Bmal2，Cloc，Per2，Per3，Cry1，Cry

4、2)在等級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞和膜細(xì)胞以及輸卵管的四個(gè)部位中的表達(dá)情況，運(yùn)用余弦分析法檢測其表達(dá)是否呈現(xiàn)顯著性節(jié)律震蕩，結(jié)合生物鐘運(yùn)行的分子機(jī)制，將時(shí)鐘基因在一個(gè)晝夜周期內(nèi)的表達(dá)規(guī)律加以組合，根據(jù)峰值時(shí)間關(guān)系確定生物鐘發(fā)條機(jī)制在該組織中是否存在。
　　結(jié)果表明:生物鐘發(fā)條機(jī)制在F1-F3卵泡的顆粒細(xì)胞以及輸卵管的傘部和子宮部中存在，并且確定了在其他檢測組織中（如膜細(xì)胞）不存在運(yùn)行的生物鐘發(fā)條機(jī)制。比較顆粒細(xì)胞中生物鐘節(jié)律的強(qiáng)度和時(shí)相狀態(tài)

5、（標(biāo)志性時(shí)鐘基因的峰值時(shí)間）發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1中節(jié)律震蕩最強(qiáng)，F(xiàn)2次之，F(xiàn)3最小，但它們之間的時(shí)相狀態(tài)沒有明顯區(qū)別。輸卵管的子宮部時(shí)相狀態(tài)要顯著早于傘部。
　　3.促黃體素對(duì)時(shí)鐘基因表達(dá)的調(diào)控及機(jī)理研究
　　本研究通過添加特異性的信號(hào)通路阻斷劑，從時(shí)鐘基因的表達(dá)變化來探索促黃體素(Luteinizing hormone，LH)對(duì)時(shí)鐘基因調(diào)控的分子機(jī)理。體外培養(yǎng)的F1顆粒細(xì)胞施加地塞米松同步化處理作為對(duì)照組，試驗(yàn)組添加LH處理。結(jié)果發(fā)

6、現(xiàn)，24小時(shí)周期內(nèi)，對(duì)照組和試驗(yàn)組中時(shí)鐘基因表達(dá)趨勢都較平緩，余弦分析節(jié)律性時(shí)均未達(dá)到顯著水平。施加LH處理4個(gè)小時(shí)后(Zeitgeber Time4，ZT4)，Bmal1的表達(dá)量顯著增高;Per2在ZT4和ZT8兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)試驗(yàn)組均顯著的高于對(duì)照組;Clock在LH處理后表達(dá)不再有任何波動(dòng)變化;Cry1在ZT12，ZT20，ZT24三個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量都是試驗(yàn)組顯著的高于對(duì)照組。添加cAMP抑制劑(H89)可以阻斷LH對(duì)時(shí)鐘基因Bmal1和

7、Per2的促進(jìn)作用，證明了LH對(duì)時(shí)鐘基因的調(diào)控依賴于cAMP/PKA信號(hào)通路。單獨(dú)抑制Erk1/2和p38MAPK信號(hào)通路對(duì)Bmal1的阻斷作用不顯著，但都顯著的阻斷了對(duì)Per2的促進(jìn)作用，當(dāng)同時(shí)抑制Erk1/2和p38MAPK時(shí)，Bmal1和Per2的表達(dá)均接近對(duì)照組，顯著的低于LH處理組，證明了Erk1/2和p38MAPK兩條通路協(xié)同作用傳導(dǎo)LH帶來的胞外信號(hào)。
　　4.全面篩選F1卵泡顆粒細(xì)胞中的時(shí)控基因
　　本研究采

8、用高通量測序技術(shù)檢測了F1卵泡中顆粒細(xì)胞在一個(gè)完整晝夜周期內(nèi)的表達(dá)譜，通過“JTK_CYCLE”算法篩選時(shí)控基因（受生物鐘發(fā)條機(jī)制調(diào)控的基因），全景式的描述卵泡顆粒細(xì)胞生物鐘參與的生理過程和調(diào)控通路。結(jié)果表明:365個(gè)基因具有晝夜節(jié)律性表達(dá)，調(diào)控和參與了眾多的生理功能和生物學(xué)過程，主要富集在核糖體蛋白和剪切蛋白通路。核糖體蛋白和腫瘤發(fā)生有密切的關(guān)系，因此母雞卵泡可作為研究卵巢癌的模型;剪切蛋白負(fù)責(zé)的剪切作用是一種重要的轉(zhuǎn)錄后修飾，表明發(fā)