湖羊卵泡顆粒細(xì)胞相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選和鑒定及抗氧化物對(duì)GSTA1表達(dá)的影響.pdf

1、本研究以湖羊卵泡顆粒細(xì)胞為試驗(yàn)對(duì)象，利用抑制消減雜交技術(shù)篩選和鑒定了與湖羊卵泡成熟相關(guān)的差異表達(dá)基因，探討了多胎候選基因骨形態(tài)蛋白15(BMP15)和生長(zhǎng)分化因子.9(GDF-9)受體基因在湖羊卵泡成熟過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律，并以體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞為模型研究了激素和茶多酚對(duì)差異表達(dá)基因的影響。這對(duì)充分利用湖羊的多胎性能，揭示綿羊卵泡發(fā)育的分子機(jī)制和改進(jìn)綿羊胚胎工程技術(shù)具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　 1.湖羊卵泡顆粒細(xì)胞BMP15和

2、GDF-9受體基因表達(dá)的變化及激素對(duì)其表達(dá)的影響
　　 湖羊經(jīng)促卵泡刺激素(FSH)處理后屠宰，將剝離的有腔卵泡分為成熟卵泡( LF，>5mm)和生長(zhǎng)卵泡(SF，3-5mm)，分離卵泡顆粒細(xì)胞；以體外培養(yǎng)綿羊卵泡（2-5mm）顆粒細(xì)胞為模型，添加不同濃度FSH(0、l、5、10ng/ml)或與E2（lng/ml）協(xié)同作用處理細(xì)胞；熒光定量PCR法檢測(cè)卵泡顆粒細(xì)胞中BMPRII、BMPRIB和ALK-5mRNA的表達(dá)量。結(jié)果顯示，

3、與生長(zhǎng)卵泡顆粒細(xì)胞相比，成熟卵泡顆粒細(xì)胞中BMPRII、BMPRIB和ALK-5mRNA的表達(dá)量分別提高了1.46、1.86和1.53倍。與對(duì)照組相比，添加FSH(1-10ng/ml)顯著降低BMPRIBmRNA表達(dá)水平(P<0.05)，5ng/mlFSH對(duì)BMPRII和ALK-5mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響。FSH與E2協(xié)同作用使BMPRII、BMPRIB和ALK-5mRNA的表達(dá)量較對(duì)照組分別提高了2.81、2.76和8.39倍(P<0.

4、01)。以上結(jié)果提示，BMP15和GDF-9及其受體基因在綿羊卵泡發(fā)育、成熟過(guò)程中起重要的作用。BMP15和GDF-9受體基因在綿羊卵泡顆粒細(xì)胞中差異表達(dá)，其機(jī)制可能與FSH和E2協(xié)同作用調(diào)控有關(guān)。
　　 2.湖羊成熟卵泡顆粒細(xì)胞差異表達(dá)基因的篩選和鑒定
　　 利用抑制消減雜交技術(shù)篩選湖羊卵泡發(fā)育分化過(guò)程中不同階段之間差異表達(dá)的基因。從分離的成熟卵泡和生長(zhǎng)卵泡顆粒細(xì)胞中提取總RNA，構(gòu)建了湖羊卵泡顆粒細(xì)胞正、反雙向cDN

5、A消減文庫(kù)。在正、反向文庫(kù)中，分別隨機(jī)挑選了384個(gè)克隆，再經(jīng)斑點(diǎn)雜交驗(yàn)證。根據(jù)斑點(diǎn)雜交信息，挑選了92個(gè)克隆進(jìn)行單向測(cè)序，獲得90個(gè)EST，聚類(lèi)后通過(guò)BLAST比對(duì)，共有38個(gè)與已知功能的基因相似，15個(gè)與已知但功能未知的基因相似，14個(gè)為新EST(Genbank登錄號(hào)為EY202207，F(xiàn)D480266-FD480278)。熒光定量PCR進(jìn)一步證實(shí)了LAPTM4A、SERPINE2、GSTA1和INHBA在成熟卵泡顆粒細(xì)胞的表達(dá)量均

6、顯著高于生長(zhǎng)卵泡顆粒細(xì)胞（P<0.05）。本研究中這些差異基因的發(fā)現(xiàn)為深入分析綿羊卵泡發(fā)育機(jī)制尤其是卵泡成熟相關(guān)的基因，進(jìn)而用于綿羊多胎的分子育種奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.湖羊GSTA1的克隆及FSH對(duì)其表達(dá)的影響
　　 克隆了湖羊卵泡顆粒細(xì)胞谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶A1(GSTAI)基因的cDNA序列，并探討了FSH對(duì)GST酶活性及GSTAlmRNA表達(dá)的影響。根據(jù)湖羊卵泡顆粒細(xì)胞SSH文庫(kù)鑒定出的GSTAlEST序列，用電子

7、克隆及RT-PCR方法獲得了840bp的GSTA1基因序列（GenBank登錄號(hào)：EU399787），其開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)666bp，編碼222個(gè)氨基酸。推測(cè)的湖羊GSTA1氨基酸序列與牛、豬和人GSTA1序列的同源性分別為98％、88％和82％。RT-PCR結(jié)果顯示：GSTA1在綿羊黃體、肝、腎、睪丸和肺中都有轉(zhuǎn)錄，在黃體、肝和睪丸中表達(dá)水平較高，肺和腎中表達(dá)次之，在心、子宮和垂體中未見(jiàn)明顯表達(dá)。分別用O、1、5和10ng/ml的FSH處理

8、體外培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞。結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，10ng/ml FSH使GST酶活性提高了68.8％(P<0.05)，GSTAlmRNA的表達(dá)量升高了2.07倍(P<0.05)。上述結(jié)果表明，GSTA1基因表達(dá)特異性可能與其功能密切相關(guān)，且FSH可調(diào)控GSTAlmRNA表達(dá)，提示GSTA1可在激素調(diào)控下參與綿羊卵泡發(fā)育，尤其是在卵泡成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　 4.茶多酚對(duì)氧化損傷誘導(dǎo)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡的影響
　　 利

9、用次黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶(HX/XO)活性氧自由基產(chǎn)生系統(tǒng)建立綿羊卵泡顆粒細(xì)胞氧化損傷模型，通過(guò)MTT法、熒光顯微鏡觀察、分光光度法、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、熒光定量PCR，探討茶多酚(GTPs)對(duì)氧化損傷誘導(dǎo)的綿羊卵泡顆粒細(xì)胞凋亡和GSTA1表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，HX/XO(1mM/1;1mU/ml)可通過(guò)氧化損傷誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，以劑量效應(yīng)使顆粒細(xì)胞GSH水平和GST酶活性顯著降低，MDA形成增加(P<0.05)，同時(shí)可使GSTAlmRNA

10、表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。低濃度GTPs（10μg/ml)對(duì)顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化無(wú)顯著影響，高濃度GTPs(>20μg/ml)對(duì)顆粒細(xì)胞增殖有抑制作用；與HX/XO組相比，GTPs（5，10μg/ml）能顯著緩解HX/XO系統(tǒng)引起的顆粒細(xì)胞氧化損傷，使存活的細(xì)胞數(shù)目顯著增加(P<0.05);GTPs(10μg/ml)處理可提高HX/XO誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞GST酶活和GSH水平降低，抑制MDA的產(chǎn)生(P<0.05)，同時(shí)顯著提高GST