雙自殺基因重組腺病毒靶向治療大腸癌的體外實驗研究.pdf

1、研究背景:在世界范圍內(nèi)，大腸癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第三位。它惡性程度高，進展快，轉移早。如何有效治療大腸癌，抑制轉移，是目前腫瘤基因治療的一個難點。在眾多治療方法中，自殺基因治療是其中研究較多的領域。自殺基因，又稱為前藥敏感基因，是病毒和細菌等原核生物含有的一類基因，其編碼的酶能將原來無毒的或微毒的藥物前體轉化成具有細胞毒性的代謝物進而殺傷宿主細胞。如TK基因通過編碼生成的胸苷激酶特異地將核苷類似藥物前體(GCV)磷酸化，進而在細胞內(nèi)代

2、謝成三磷酸丙氧鳥苷，后者抑制細胞DNA聚合酶的功能或競爭性的滲入細胞DNA，使其合成終止，導致細胞死亡；CD基因則通過編碼胞嘧啶脫氨酶將無毒的前體藥物5-FC代謝成抗DNA合成的化療藥5-FU從而殺傷細胞。該療法不但能直接殺傷轉基因的腫瘤細胞，還可利用其獨特的“旁觀者效應”殺傷周圍大量未轉基因的瘤細胞，具有先轉染后治療、可靶向作用、可誘導免疫等優(yōu)點，使該治療方法在腫瘤的基因治療中具有獨特的優(yōu)勢。但同時，目的基因轉導率低、反復治療后腫瘤細

3、胞具有抗藥性和類型不同的腫瘤細胞各自敏感的自殺基因治療系統(tǒng)不同等缺點嚴重影響了自殺基因治療的應用效果。如何采取更有效的自殺基因系統(tǒng)是目前所急需解決的問題。 本課題擬構建以KDR啟動子調(diào)控下的CD/TK雙自殺基因重組腺病毒，靶向治療大腸癌；一方面雙自殺基因選擇性殺傷高表達KDR的大腸癌細胞；另一方面，KDR啟動子介導雙自殺基因選擇性殺傷分化迅速的腫瘤的血管內(nèi)皮細胞，破壞腫瘤血供，進而殺傷大腸癌。兩者協(xié)同作用，雙途徑，多方位的治療大

4、腸癌。 目的:研究KDR啟動子調(diào)控下的雙自殺基因重組腺病毒系統(tǒng)靶向殺傷大腸癌細胞，為腫瘤的基因靶向治療提供實驗依據(jù)。首先利用改進的AdEasy系統(tǒng)構建攜帶KDR啟動子/CMV啟動子調(diào)控的雙自殺基因的重組復制缺陷型腺病毒。通過構建AdEasier-1細菌后進行細菌內(nèi)同源重組的“兩步轉化法”來簡化實驗過程。構建好的腺病毒用于感染表達KDR受體的大腸癌LOVO細胞和血管內(nèi)皮ECV304細胞，及不表達KDR受體的LS174T細胞，測定感

5、染效率，檢測轉基因的表達，對轉基因細胞施以前藥，觀察轉基因細胞對前藥的敏感性，比較不同轉基因細胞對前藥的敏感性差異；用流式細胞儀檢測治療對細胞周期的影響。 結論: 一.應用兩步轉化法成功構建腺病毒重組體，經(jīng)PCR鑒定擴增出目的片段。實驗證明兩步轉化法的方法可行、周期短、費用低； 二.KDR驅(qū)動雙自殺基因系統(tǒng)對大腸癌LOVO細胞和靜脈內(nèi)皮細胞ECV304具有強殺傷作用，其殺傷效率與前藥濃度和重組病毒MOI相關。