胃癌PAI-1遺傳不穩(wěn)定性、5’側(cè)翼區(qū)甲基化及BTG3啟動(dòng)子區(qū)甲基化與臨床病理特征的相關(guān)性研究.pdf

1、第一部分、胃癌PAI-1基因遺傳不穩(wěn)定性和5’-側(cè)翼區(qū)CpG位點(diǎn)甲基化研究
　　 研究背景：我國是胃癌的高發(fā)和高死亡率國家。起病隱匿且惡變率高，尋找早期診斷和指導(dǎo)治療的臨床檢測(cè)指標(biāo)顯得刻不容緩。最新研究發(fā)現(xiàn)，胃癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因遺傳(genetic)與表觀遺傳(epigenetic)共同參與的結(jié)果。
　　 基因遺傳研究證明，抑癌基因失活在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用。遺傳不穩(wěn)定性能增加突變率，使抑癌基因功能失調(diào)。

2、微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability，MSI)和雜合性缺失(10ssofheterozygosity，LOH)被認(rèn)為是基因遺傳不穩(wěn)定性的兩個(gè)主要表型特征；表觀遺傳調(diào)控是可遺傳的通過對(duì)DNA和組蛋白等的修飾影響基因表達(dá)。這種修飾同時(shí)會(huì)產(chǎn)生表觀遺傳學(xué)標(biāo)記，其中以DNA甲基化和組蛋白乙?；顬槌Ｒ姟NA異常的高甲基化可導(dǎo)致抑癌基因的表達(dá)失活。
　　 PAI-1可調(diào)節(jié)組織型纖溶酶原激活物(tPA)和尿激酶

3、型纖溶酶原激活物(uPA)的活性。該系統(tǒng)對(duì)纖維蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有水解作用。其中基膜的降解，可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞向正常組織的浸潤，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織比正常組織有更高的PAI-1基因表達(dá)量，認(rèn)為高水平的PAI-1，是胃癌患者預(yù)后不良的指標(biāo)。但是導(dǎo)致該基因表達(dá)異常的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 研究目的：本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)定位于7號(hào)染色體長(zhǎng)臂的PAI-1基因pai-1、D7S471和D7S515三個(gè)位點(diǎn)的基因遺傳不穩(wěn)定

4、性和該基因+10到+129區(qū)域CpG島甲基化水平；闡明它們與胃癌發(fā)生、淋巴轉(zhuǎn)移、漿膜浸潤、分化程度、TNM分期等臨床病理學(xué)特性的關(guān)系。揭示尿激酶性纖溶酶原激活物抑制因子(PAI-1)與腫瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性；探討PAI-1基因在胃癌組織中異常表達(dá)的基因遺傳和表觀遺傳機(jī)制，為尋找胃癌早期診斷和指導(dǎo)治療的臨床檢測(cè)指標(biāo)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：(1)苯酚-氯仿抽提法，提取50對(duì)冰凍新鮮胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織的基因組DNA。(2)P

5、CR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single-StrandConformationPolymorphism，SSCP)、常規(guī)銀染檢測(cè)位點(diǎn)的遺傳不穩(wěn)定性。(3)胃癌組織基因組DNA重亞硫酸鹽處理，MS-PCR檢測(cè)+10到+129區(qū)域CpG島甲基化水平。(4)SPSS16.0軟件統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)性。
　　 研究結(jié)果：(1)浸潤至粘膜層和肌層的胃癌MSI檢出率(未超出漿膜)，高于浸潤至漿膜外組織(42.86％vs.2.33％，P=0.031)；MS

6、I發(fā)生率在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(2.56％)，明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(2.56％vs.18.18％，P=0.007)；但在低分化組的MSI發(fā)生率高于中度和高度分化組(21.05％vs.0.00％，P=0.027)。(2)PAI-1基因+10到+129區(qū)域的CpG島甲基化水平與胃癌臨床病理學(xué)問無顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：PA-1基因的MSI發(fā)生率在胃癌轉(zhuǎn)移抑制的過程中起了重要作用，可作為胃癌惡化及進(jìn)展的一個(gè)指標(biāo)；但是LOH并未顯示相

7、關(guān)性，提示遺傳不穩(wěn)定性的兩個(gè)方面：LOH和MSI可能通過不同的機(jī)制調(diào)節(jié)；PAI-1基因+10到+129區(qū)域的CpG島甲基化水平與胃癌臨床病理學(xué)關(guān)系無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能不是影響胃癌發(fā)生與惡性進(jìn)展的主要因素。
　　 第二部分、金雀宜黃素表觀遺傳學(xué)調(diào)控BTG3基因表達(dá)誘導(dǎo)胃癌G2/M期周期阻滯的研究
　　 研究背景：表觀遺傳學(xué)調(diào)控是指在不改變基因組序列的前提下，通過對(duì)DNA和組蛋白的修飾來調(diào)控基因表達(dá)。國內(nèi)外已有專家研究表明，異

8、常的DNA甲基化和組蛋白乙?；怯杏玫哪[瘤診斷分子標(biāo)記?？梢杂糜谀[瘤發(fā)生的早期預(yù)測(cè)，也可用于腫瘤的分級(jí)。目前表觀遺傳學(xué)研究主要集中在抑癌基因，其啟動(dòng)子區(qū)域的異常高甲基化常常是抑癌基因失活、腫瘤發(fā)生的因素。
　　 B-celltranslocationgene3(BTG3/ANA/APRO4)是一個(gè)潛在的抑癌基因，在很多惡性腫瘤中呈現(xiàn)低表達(dá)。屬BTG家族，該家族很多基因具有調(diào)節(jié)生長(zhǎng)和周期的作用。研究者認(rèn)為一些腫瘤，如乳腺癌、口腔鱗

9、狀上皮癌、腎癌、前列腺癌等的發(fā)展可能與21號(hào)染色體長(zhǎng)臂的抑癌基因BTG-3的缺失及啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異常的共同作用有關(guān)。在胃癌病人中，已報(bào)道BTG-3在血漿中含量越高，疾病預(yù)后越好。而BTG-3基因在胃癌中表觀遺傳學(xué)改變?cè)趪鴥?nèi)外尚未見報(bào)道。
　　 研究發(fā)現(xiàn)，抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變，可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。逆轉(zhuǎn)表觀遺傳改變的藥物為這類腫瘤的治療提供了新的前景。金雀宜黃素(Gen)是大豆類固醇激素，在前列腺癌治療的研究中已進(jìn)入

10、臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)階段。Gen對(duì)多種腫瘤具有抑制作用，近年來發(fā)現(xiàn)Gen有逆轉(zhuǎn)基因的甲基化、乙?；淖饔?。在胃癌中，Gen對(duì)抑癌基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)的調(diào)節(jié)，及其抑制腫瘤生長(zhǎng)的分子生物學(xué)機(jī)制是本研究的重要內(nèi)容。
　　 研究目的：通過研究BTG3基因在胃癌中的表達(dá)與表觀遺傳學(xué)調(diào)控的關(guān)系，探討金雀宜黃素是否可以像工具藥五氮雜胞苷一樣逆轉(zhuǎn)表觀遺傳的改變。同時(shí)，闡明金雀宜黃素與BTG3基因在周期阻滯的作用機(jī)制，探討金雀宜黃素引起周期阻滯與BTG3

11、基因的關(guān)系。
　　 研究方法：Real-timePCR檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)水平；Westernblot檢測(cè)該基因蛋白的表達(dá)量；亞硫酸鹽修飾，DNA片段克隆測(cè)序檢測(cè)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化；細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株7901、AGS、803、K45以及正常胃壁永生化細(xì)胞株Ges-1；實(shí)驗(yàn)藥金雀宜黃素，工具藥五氮雜胞苷分別濃度梯度和時(shí)間梯度處理細(xì)胞。PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期阻滯及凋亡；生長(zhǎng)抑制則使用CCK-8試劑盒檢測(cè)。
　　 研

12、究結(jié)果：我們發(fā)現(xiàn)BTG3基因在胃癌中的表達(dá)量受到抑制，Real-timePCR與Westernblot檢測(cè)結(jié)果相似。82.50％(33例/40例)BTG3在癌組織中低表達(dá)。其中66.7％(22例/33例)的病例出現(xiàn)強(qiáng)抑制性表達(dá)。與臨床病理特征的相關(guān)性，在淋巴轉(zhuǎn)移組的BTG3基因表達(dá)量明顯少于未有淋巴轉(zhuǎn)移組，揭示BTG3基因表達(dá)產(chǎn)物的保護(hù)作用；胃癌細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果相似，基因表達(dá)量受到抑制；DNA克隆測(cè)序顯示，BTG3基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG位點(diǎn)

13、在胃癌組織和胃癌細(xì)胞中普遍呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)；Real-timePCR與Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在Gen和5-Aza處理后，都逆轉(zhuǎn)了BTG3基因在胃癌中的表達(dá)量，克隆測(cè)序結(jié)果證實(shí)藥物同時(shí)逆轉(zhuǎn)了BTG3基因啟動(dòng)子區(qū)高甲基化；CCK-8結(jié)果顯示藥物抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度的依賴性。其中Gen(50μMfor72h)and5Aza(10μMfor72h)最為明顯；Gen50μM處理后的7901，803，k45細(xì)胞出現(xiàn)了G2-M期

14、的周期阻滯。
　　 結(jié)論：1、BTG3基因在胃癌組織及胃癌細(xì)胞株中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，基因表達(dá)產(chǎn)物具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移惡化的作用，為胃癌的抑癌基因；胃癌中BTG3基因的沉默是由于基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化增高引起的；2、金雀宜黃素可以像工具藥物五氮雜胞苷一樣通過去甲基化作用，逆轉(zhuǎn)抑癌基因的表達(dá)，從而治療因甲基化異常導(dǎo)致的腫瘤。體現(xiàn)了金雀宜黃素在治療因表觀遺傳學(xué)異常而導(dǎo)致的腫瘤中所具有的價(jià)值；3、金雀宜黃素與BTG3基因在周期阻滯方面有著相似的