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文檔簡介
1、目的:利用重疊延伸拼接(splicing by overlap extension,SOE)PCR技術(shù)構(gòu)建相對排列的U6/H1雙啟動子siRNA表達框架(siRNAexpression cassettes,SECs),并針對人端粒酶hTERT基因外顯子不同片段構(gòu)建三條U6/H1雙啟動子SECs,通過對肝癌細胞株HepG2細胞端粒酶hTERT基因表達進行RNA干擾來考察U6/H1啟動子SECs的干擾作用,從而為siRNA的制備及腫瘤基因治
2、療探索新的途徑。 方法:分別以pSUPER質(zhì)粒和pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒為模板,根據(jù)端粒酶hTERT基因外顯子核酸序列(genebank (NM_198253))1778-1796,2650-2668,1943-1961三個位點分別設(shè)計特異引物,利用重疊延伸拼接PCR方法構(gòu)建兩端為相對排列的U6和H1啟動子、中間部分為與端粒酶hTERT特定序列同源的可雙向轉(zhuǎn)錄的SECs。將該產(chǎn)物純化后用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細胞,
3、用適時熒光定量PCR法檢測細胞hTERT mRNA的表達量,用TRAP-PCR銀染法定性檢測端粒酶活性,來觀察構(gòu)建的U6、H1雙啟動子SECs的RNA干擾作用。 結(jié)果:2.5%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物顯示:第一階段PCR反應(yīng)產(chǎn)物單U6啟動子正義SECs片段、單H1啟動子反義SECs片段長度分別為335bp和245bp,第二階段PCR片段長度分別為反應(yīng)產(chǎn)物U6、H1雙啟動子SECs片段長度為561bp。將四段雙啟動子SECs產(chǎn)
4、物純化后分別轉(zhuǎn)染HepG2細胞,檢測端粒酶hTERT mRNA及活性,針對hTERT(genebank NM_198253)1778-1796,2650-2668,1943-1961的U6、H1雙啟動子SECs對后hTERT mRNA量顯著下降,端粒酶活性明顯降低。hTERTmRNA表達的抑制率分別為37.0%、50.1%和37.0%。處理組的相對端粒酶活性抑制率分別為55.0%、76.5%和47.6%。而陰性對照SECs無RNA干擾作
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