體外構(gòu)建雙H1啟動(dòng)子SECs及其對(duì)HepG2細(xì)胞端粒酶活性抑制的研究.pdf

1、目的：利用融合 PCR 技術(shù)構(gòu)建雙 H1 啟動(dòng)子 siRNA 表達(dá)框架(siRNAexpression cassettes，SECs)，并針對(duì)人端粒酶hTERT基因外顯子不同片斷構(gòu)建兩條雙H1啟動(dòng)子SECs，通過(guò)對(duì) HepG2細(xì)胞端粒酶hTERT基因表達(dá)進(jìn)行RNA干擾來(lái)驗(yàn)證雙H1啟動(dòng)子SECs的有效性，從而為siRNA的制備及對(duì)腫瘤的抑制提供新的途徑。 方法：以pSUPER質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增得H1啟動(dòng)子序列；根據(jù)端粒酶hT

2、ERT基因外顯子核酸序列(genebank NM_003219)1778-1796和2346-2364兩段序列分別設(shè)計(jì)引物，利用融合PCR方法分三步構(gòu)建兩端為H1啟動(dòng)子中間為端粒酶特定序列可雙向轉(zhuǎn)錄的SECs。將PCR產(chǎn)物純化后用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，用TRAP—銀染法和TRAP—ELISA法定性和定量檢測(cè)端粒酶活性，驗(yàn)證雙H1啟動(dòng)子SECs是否發(fā)揮RNA的干擾作用。 結(jié)果：2[％]瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物顯示：

3、第一步PCR 反應(yīng)產(chǎn)物單H1啟動(dòng)子正義(反義)SECs片段長(zhǎng)度為251bp，第三步PCR反應(yīng)產(chǎn)物雙H1啟動(dòng)子SECs片段長(zhǎng)度為483bp。將第一步與第三步PCR反應(yīng)產(chǎn)物純化后分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，檢測(cè)端粒酶活性，單H1啟動(dòng)子正義(反義)SECs均無(wú)RNA干擾作用，端粒酶活性檢測(cè)未見(jiàn)抑制。而針對(duì)hTERT(genebankNM_003219)1778—1796和2346—2364的雙H1啟動(dòng)子SECs對(duì)端粒酶活性的抑制率分別為58.6[