p38絲裂原活化蛋白激酶在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣中作用的實驗研究.pdf

1、腦血管痙攣(cerebrovascularvasospasmCVS)是動脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoidhemorrhageSAH)后最常見的并發(fā)癥之一，它的高致死率(15～20％)、致殘率(約50％)嚴(yán)重威脅到人類的健康。CVS通常分為兩種：一是SAH后破入蛛網(wǎng)膜下腔中的血液對腦血管的機械性刺激作用所致的暫時性或早發(fā)性CVS。這種早發(fā)性CVS在動物實驗中?？梢姷?，但在人類證據(jù)尚不充分；二是出血數(shù)天后發(fā)生、持續(xù)時間較長的遲

2、發(fā)性CVS(delayedcerebrovascularvasospasmDCV)。DCV是臨床上最常見的CVS，一旦發(fā)生，往往難以逆轉(zhuǎn)，對血管擴張劑的反應(yīng)較差，導(dǎo)致進一步的缺血性腦損害。CVS的治療缺乏十分有效的方法，原因在于致病機理迄今尚未明了。目前研究認為SAH后血凝塊的一些分解產(chǎn)物，如血紅蛋白(Hb)、內(nèi)皮素(ET)、凝血酶(thrombi)、5-羥色胺(5-HT)等能引起腦血管收縮，但并不能完全解釋CVS的致病機制。近幾年來研

3、究發(fā)現(xiàn)，平滑肌細胞收縮調(diào)節(jié)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制(signaltransductionpathways)可能會誘導(dǎo)CVS的發(fā)生。此機制主要通過三個途徑誘導(dǎo)平滑肌的收縮運動：①肌球蛋白輕鏈激酶(myosinlightchainkinaseMLCK)途徑②蛋白激酶C(proteinkinaseCPKC)途徑③促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinaseMAPK)途徑。其中MLCK途徑在多個實驗性研究中被證實參與

4、了SAH后早發(fā)性CVS的形成，而PKC途徑是否在CVS中起作用存在爭論。MAPK途徑目前處于實驗研究階段，相關(guān)報道甚少。p38是MAPK家族成員之一，目前明確在各種生命活動中發(fā)揮廣泛而重要的作用，包括：①調(diào)節(jié)細胞的增生②調(diào)節(jié)細胞的調(diào)亡③調(diào)節(jié)基因表達④誘導(dǎo)致炎細胞因子的產(chǎn)生。本研究針對p38的生物功效，通過兩個方面探討p38MAPK在CVS中的作用。 第一部分初步探討p38MAPK在CVS中的作用 研究目的是研究p38MA

5、PK在兔二次注血模型后痙攣的基底動脈平滑肌細胞中的表達與基底動脈變化規(guī)律的關(guān)系，初步探討p38MAPK在腦血管痙攣形成機制中的作用。35只雌性新西蘭白兔，體重2.8～3.0Kg，隨機分為：對照組(N=5)，SAH組(N=10)、SAH+DMSO(N=10)、SAH+SB203580組(N=10)。其中SAH組、SAH+DMSO組、SAH+SB203580組每組又分別按照在首次注血后day5、day7活體灌注處死進行對照而分為2個小組(n

6、=5)。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型，即在day0和day2時分別經(jīng)枕大池兩次注射自體動脈血(0.5ml/Kg)。從day3開始，SAH+DMSO、SAH+SB203580兩組動物，枕大池內(nèi)分別注入干預(yù)藥物DMSO、p38MAPK特異性抑制劑SB203580，持續(xù)到各組處死前一天。動物處死采用活體經(jīng)左心室灌注10％的緩沖中性甲醛。處死后，立即開顱取含有基底動脈全長的腦干及腦組織，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底動

7、脈先用石蠟包埋，在每個血管的近、中、遠段的中點取材，每點連續(xù)取3個4μm的切片，切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢查。采用同濟醫(yī)科大學(xué)高分辨醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(HMIAP-2000)測量血管周長和觀察p38MAPK陽性表達情況。血管橫截面積根據(jù)數(shù)學(xué)公式：半徑=周長/2π、面積=π×半徑2計算得出；而p38MAPK陽性表達的量化分析采用文獻報道的一個量化評分表計算得出。方差分析(One-wayANOVA，LSD)和非參數(shù)檢驗(Mann-Whi

8、tneyU)兩種統(tǒng)計方法用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 HE染色：對照組動物的基底動脈HE染色顯示組織結(jié)構(gòu)正常，基底動脈外膜膠原纖維較薄。在day5，SAH組、SAH+DMSO組出現(xiàn)管徑狹窄、內(nèi)膜出現(xiàn)明顯皺褶、平滑肌細胞肥大、壞死、扭曲變形，外膜膠原纖維明顯增多變厚且有粒細胞和單核細胞浸潤；而在SAH+SB203580組基底動脈管徑出現(xiàn)的一系列變化基本恢復(fù)：內(nèi)皮恢復(fù)平滑，只出現(xiàn)少量破損；平滑肌層細胞間隙基本恢復(fù)、外膜炎性反應(yīng)基本消失、膠原纖

9、維增生明顯緩解。在day7，所有實驗組動物基底動脈基本趨于正常。 免疫組織化學(xué)：p38MAPK在內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中表達，定位于胞膜和胞漿。對照組動物基底動脈p38MAPK免疫反應(yīng)輕微，幾乎沒有出現(xiàn)(量化評分為0)。SAH后day5，p38MAPK在SAH組、SAH+DMSO組動物基底動脈上的表達強烈(量化評分分別是2、1.80)，主要反應(yīng)在平滑肌細胞上，與對照組有明顯差異(P＜0.01)。而SAH+SB203580組動物基底

10、動脈上p38MAPK的免疫反應(yīng)明顯減弱(量化評分為0.20)與對照組相比無明顯差異(P＞0.05)，但與SAH組、SAH+DMSO組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在day7，實驗組動物基底動脈平滑肌層p38MAPK表達與對照組無明顯差異(P＞0.05)。 以上結(jié)果顯示：兔枕大池二次注血模型基底動脈在注血后day5時出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)改變：包括動脈管腔狹窄、內(nèi)皮細胞損傷、平滑肌細胞肥大及外膜膠原纖維增生、炎癥細胞浸潤等病理改變與

11、文獻報道人類SAH痙攣動脈類似。免疫組織化學(xué)的研究顯示：兔基底動脈注血后day5，基底動脈出現(xiàn)明顯收縮的同時p38MAPK在平滑肌細胞上表達顯著增強；而在注血后day7兩者恢復(fù)到注血前水平，表明p38MAPK表達增強程度的變化與注血后CVS程度隨著時間的變化一致。應(yīng)用p38MAPK特異性抑制劑后，兔基底動脈形態(tài)學(xué)的改變不明顯，與對照組相似。平滑肌的收縮顯著緩解，同時p38MAPK的表達也明顯減輕。這些結(jié)果提示p38MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的

12、激活可能是遲發(fā)性CVS發(fā)生發(fā)展的重要機制。 第二部分p38MAPK誘導(dǎo)的致炎細胞因子TNF-α在CVS中的作用 炎癥免疫反應(yīng)與CVS的關(guān)系密切，而誘導(dǎo)致炎細胞因子生成是p38MAPK一個重要的生物效應(yīng)。前面的實驗結(jié)果提示了激活的p38MAPK在遲發(fā)性CVS中的重要作用，本研究的目的就是進一步的探討由p38MAPK誘導(dǎo)的致炎細胞因子在CVS發(fā)生、發(fā)展中的作用。30只雌性新西蘭白兔，體重2.8～3.0Kg，隨機分為5組：①對

13、照組；②SAH-day3組③SAH-day5組④SAH+DMSO組⑤SAH+SB203580組。采用枕大池二次注血的方法建立SAH模型。每只動物在首次注血前和處死前行枕大池穿刺留取腦脊液1ml，以1500r/min的速度在離心機上離心15min，取上清，立即-80℃低溫保存。從day3開始，SAH+DMSO、SAH+SB203580兩組動物，枕大池內(nèi)分別注入干預(yù)藥物DMSO、p38MAPK特異性抑制劑SB203580，持續(xù)到各組處死前一

14、天。動物處死采用活體經(jīng)左心室灌注10％的緩沖中性甲醛。處死后，立即開顱取含有基底動脈全長的腦干及腦組織，置于10％的中性甲醛中保存、固定。固定后的基底動脈先用石蠟包埋，在每個血管的近、中、遠段的中點取材，每點連續(xù)取3個4μm的切片，切片用于HE染色和免疫組織化學(xué)檢查。采用同濟醫(yī)科大學(xué)高分辨醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(HMIAP-2000)測量血管周長和觀察p38MAPK陽性表達情況。血管橫截面積根據(jù)數(shù)學(xué)公式：半徑=周長/2π、面積=π×半徑2計算

15、得出；而p38MAPK陽性表達的量化分析采用文獻報道的一個量化評分表計算得出。腦脊液中的TNF-α濃度采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定。方差分析(One-wayANOVA，LSD)、非參數(shù)檢驗(Mann-WhitneyU)、pearson相關(guān)性分析統(tǒng)計方法用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。 以上結(jié)果顯示：在兔枕大池二次注血模型中，基底動脈收縮的同時平滑肌細胞p38MAPK激活并持續(xù)高表達，而外周腦脊液中的致炎細胞因子TNF-α濃度明顯升

16、高并保持穩(wěn)定；應(yīng)用抑制劑干預(yù)后，痙攣的基底動脈明顯緩解，平滑肌細胞p38MAPK表達不明顯，而外圍腦脊液中的致炎細胞因子TNF-α濃度顯著降低。pearson相關(guān)性分析顯示TNF-α濃度的變化與基底動脈橫截面積的變化呈負相關(guān)性(Pearson相關(guān)系數(shù)r=-0.812，P=0.000)。提示由CVS的形成可能不是p38MAPK的直接作用的結(jié)果，而是與其所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。 結(jié)論 1、本研究系統(tǒng)觀察了兔二次枕大池注血模

17、型后，痙攣基底動脈平滑肌細胞p38MAPK的表達的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)p38MAPK的激活和過度表達是引起CVS的主要原因。 2、觀察到二次注血后，兔腦脊液中致炎細胞因子TNF-α濃度變化的規(guī)律，發(fā)現(xiàn)TNF-α濃度的變化與兔基底動脈橫截面積的變化呈明顯的相關(guān)性，提出CVS可能是p38MAPK通過激活各種產(chǎn)細胞因子途徑，從而對細胞因子起到一個增量調(diào)節(jié)的結(jié)果，最終導(dǎo)致了血管平滑肌持續(xù)性的收縮的新理論。 3、觀察到p38MAPK特異