纖維蛋白基質(zhì)承載的IGF-I基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療缺血性心臟病的研究.pdf

1、近年來，干細(xì)胞移植修復(fù)損傷心肌一直是基礎(chǔ)和臨床研究的熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)因?yàn)榫哂衼碓磸V泛、取材方便、無免疫原性以及不涉及倫理問題等優(yōu)點(diǎn)在缺血性心臟病的治療中應(yīng)用最為廣泛。胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是胰島素家族的一種單鏈多肽類生長因子，作為生長因子生物學(xué)效應(yīng)的主要介質(zhì)，IGF-Ⅰ在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及抑制細(xì)胞凋亡、

2、壞死等方面具有重要作用。以往的研究表明，對小動物心梗模型單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用MSCs和IGF-Ⅰ進(jìn)行治療，均可不同程度的改善心肌梗死后的心功能。但將MSCs與IGF-Ⅰ聯(lián)合應(yīng)用于和人類更為接近的大動物模型研究甚少，療效尚不明確。并且，如何最有效地將干細(xì)胞與細(xì)胞因子聯(lián)合起來，如何最大程度提高細(xì)胞移植手術(shù)安全性等問題也并不十分明了，而這恰恰正是關(guān)系到細(xì)胞治療最終能否為臨床所用的關(guān)鍵問題。因此本研究在對豬心梗模型進(jìn)行優(yōu)化的基礎(chǔ)上，綜合運(yùn)用基因工程和

3、組織工程技術(shù)，以多孔纖維蛋白基質(zhì)為載體將IGF-Ⅰ過表達(dá)MSCs穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株移植到豬的梗死心肌，觀察其對梗死后心臟功能的影響以及在梗死心肌修復(fù)等方面的作用，并對其作用機(jī)制進(jìn)行初步探討。本文南四部分組成:
　　第一部分豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及鑒定
　　目的:研究豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)體外分離培養(yǎng)及向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法，并對所得MSCs及其分化結(jié)果進(jìn)行鑒定;為心肌梗死的干細(xì)胞治療提供種子細(xì)胞來源。
　　方法

4、:(1)采用密度梯度離心法，將MSCs從豬骨髓血液中分離出來，置于低糖DMEM中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。利用換液的方法將其純化。(2) MTT法測定細(xì)胞P2、P5、P8增殖曲線;(3)臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活性鑒定。(4)倒置相差顯微鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性，通過臺盼藍(lán)染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和流式細(xì)胞分選方法對其細(xì)胞膜CD44、CD90表型進(jìn)行鑒定。(5)5-氮雜胞苷(5-Aza)誘導(dǎo)P2、P5代MSCs向心肌分化，計(jì)算心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率。
　　

5、結(jié)果:(1)通過密度梯度離心聯(lián)合貼壁篩選培養(yǎng)的方法，可以在體外分離培養(yǎng)出增殖能力強(qiáng)的豬MSCs，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，各代細(xì)胞形態(tài)基本一致;原代與傳代培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線都為S型，但是傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長速度比原代快。傳代培養(yǎng)的結(jié)果顯示，在經(jīng)歷了8代培養(yǎng)以后，豬MSCs才出現(xiàn)衰老征象。與原代培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線相比，傳代培養(yǎng)的細(xì)胞生長潛伏期短，每代只要3～4天就可鋪滿培養(yǎng)皿底壁。(2)臺盼藍(lán)細(xì)胞活性結(jié)果:P2＞P5＞P8。(3)免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果得

6、知:CD44和CD90陽性表達(dá)率高于80％。(4)在相同濃度的5-Aza作用下，MSCs向心肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率隨著傳代次數(shù)的增加逐漸降低。P2代心肌數(shù)量顯著高于P5代。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)在體外成功培養(yǎng)了豬MSCs。5-Aza體外可誘導(dǎo)豬MSCs分化為心肌樣細(xì)胞;P2代MSCs在濃度為10μmol/L的5-Aza作用下，誘導(dǎo)效果最明顯。
　　第二部分 IGF-Ⅰ慢病毒載體構(gòu)建及感染豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的初步研究
　　目的:構(gòu)建

7、過表達(dá)和干擾IGF-Ⅰ慢病毒表達(dá)載體Lenti-IGF-Ⅰ，觀察過表達(dá)和干擾IGF-Ⅰ對5-Aza誘導(dǎo)骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分化為心肌樣細(xì)胞的影響。
　　方法:使用工具質(zhì)粒pCDH-GFP/pLKO.1-TRC和豬IGF-Ⅰ基因相連接，構(gòu)建出表達(dá)融合基因GFP-IGF-Ⅰ重組質(zhì)粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ。利用在pCDH-GFP-IGF-Ⅰ質(zhì)粒的上下游引物中加入BamHI/EcoRI酶的酶切位點(diǎn)方法以及與Xhol酶是同尾酶

8、的特點(diǎn)，將融合基因GFP-IGF-Ⅰ與經(jīng)BamHI/EcoRI酶雙酶切的pCDH質(zhì)粒相連接，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建的重組慢病毒轉(zhuǎn)移質(zhì)粒命名為pCDH-GFP-IGF-Ⅰ，轉(zhuǎn)化后挑選單克隆擴(kuò)增進(jìn)行PCR鑒定，正確克隆行測序鑒定。接著以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法分別將重組質(zhì)粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ和包裝質(zhì)粒psPAX2、包膜蛋白質(zhì)粒pMD2.G共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收獲病毒。攜帶pCDH-GFP-IGF-Ⅰ融合基因的慢病毒感染MSCs細(xì)胞后

9、，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達(dá)情況以明確慢病毒成功感染MSCs細(xì)胞。利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法觀察過表達(dá)和干擾IGF-Ⅰ對5-Aza誘導(dǎo)MSCs分化為心肌的IGF、GATA-4、NKX2.5、β-MHC和MEF-2c的變化。
　　結(jié)果:通過PCR和測序鑒定重組質(zhì)粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ構(gòu)建正確。重組質(zhì)粒pCDH-GFP-IGF-Ⅰ的PCR結(jié)果應(yīng)為GFP-IGF-Ⅰ融合基因片段大小約393bp，與

10、雙酶切pCDH-GFP-IGF-Ⅰ釋放出的片段大小一致，證明了融合基因成功插入pCDH質(zhì)粒中。包裝帶有豬IGF-Ⅰ基因序列的慢病毒并感染靶細(xì)胞，經(jīng)過熒光顯微鏡觀察，感染成功并且感染效率可達(dá)80％。熒光實(shí)時(shí)定量PCR、蛋白免疫印跡法和免疫組織化學(xué)法結(jié)果得出，過表達(dá)IGF-Ⅰ的MSCs細(xì)胞組IGF、GATA-4、NKX2.5、β-MHC和MEF-2c表達(dá)量顯著高于其他組，siRNA-IGF-Ⅰ的MSCs細(xì)胞組各指標(biāo)顯著低于其他組。
　

11、　結(jié)論:成功構(gòu)建了豬IGF-Ⅰ慢病毒表達(dá)載體Lenti-IGF-Ⅰ，MSCs細(xì)胞高表達(dá)IGF-Ⅰ時(shí)有利于向心肌分化。
　　第三部分豬心肌梗死/再灌注后左室重構(gòu)模型的改進(jìn)及其評價(jià)
　　目的:評價(jià)采用阻斷鈍緣支和/或?qū)侵Ы⒇i急性心肌梗死/再灌注后左室重構(gòu)模型的有效性和穩(wěn)定性。
　　方法:40只上海白豬隨機(jī)分為3組;其中假手術(shù)組（Shame組）10只，改良組（OPTI組）和LAD組各15只。所有動物術(shù)前行心臟核磁共振(M

12、RI)檢查，記錄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。全麻氣管插管后，經(jīng)左側(cè)第四肋間進(jìn)胸，改良組采用選擇性阻斷左冠狀動脈鈍緣支和/或?qū)侵?LAD組采用阻斷左冠狀動脈前降支遠(yuǎn)端1/3處，引起急性心肌梗死，阻斷60分鐘后，解除阻斷恢復(fù)心肌血供;假手術(shù)組僅開胸觀察60分鐘后常規(guī)關(guān)胸。術(shù)中全程監(jiān)測并記錄心電圖及血流動力學(xué)指標(biāo)。存活動物術(shù)后4周復(fù)查MRI、記錄血流動力學(xué)指標(biāo)后處死。比較各組間解剖數(shù)據(jù)、血流動力學(xué)指標(biāo)。比較改良組和LAD組手術(shù)死亡率、惡性心律失常發(fā)生率的差別

13、;比較兩組經(jīng)過MRI檢測所得出的左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)變異度，收縮期室壁增厚率(STF)、收縮室壁張力(SWS)變異度及心梗面積(SS)變異度，進(jìn)而判斷改良法建立豬急性心梗模型的優(yōu)劣。
　　結(jié)果:改良組3例術(shù)中發(fā)生室顫(20％)，2例死亡(13％);LAD組6例術(shù)中出現(xiàn)室顫(40％)，5例死亡(33％)。與對照組相比，手術(shù)4周后改良組和LAD組均有明顯的梗死瘢痕形成，出現(xiàn)明顯的梗死后代償性左心室重構(gòu)。MRI檢測結(jié)果顯示兩模型組整

14、體心功能均較假手術(shù)組有明顯下降。改良組在梗死面積(SS)、和整體心功能(LVEF)方面的變異程度極顯著低于LAD組(P＜0.01)，但兩組間局部室壁收縮功能指標(biāo)STF和SWS無顯著性差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論:冠狀動脈左前降支(LAD)供血范圍大，而且變異較多，以往使用的LAD結(jié)扎建立心梗模型的方法不僅死亡率高，而且所建模型穩(wěn)定性差。采用選擇性阻斷左冠狀動脈鈍緣支(OM)和/或?qū)侵?D)血供的改良法可成功建立梗死后/再灌注

15、左心室重構(gòu)模型。改良法建模不僅手術(shù)成功率更高，而且所建模型在梗死面積、左室整體收縮功能等方面的變異度均明顯優(yōu)于左前降支結(jié)扎法，為進(jìn)一步評價(jià)干細(xì)胞對大動物急性心梗的治療作用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　第四部分多孔纖維蛋白基質(zhì)承載的IGF-Ⅰ基因修飾MSCs移植對豬心肌梗死的治療作用及其機(jī)制
　　目的:探討以多孔纖維蛋白基質(zhì)為載體行IGF-Ⅰ基因修飾MSCs移植對豬心肌梗死的治療作用和機(jī)制。
　　方法:將從豬骨髓中分離出的間充

16、質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)經(jīng)基因修飾后分為僅GFP陽性表達(dá)之MSCs(cMSCs)、IGF-Ⅰ干擾MSCs(siMSCs)及IGF-Ⅰ過表達(dá)MSCs(oeMSCs)，將這些MSCs用于豬心肌梗死模型，測試其療效。2～3月齡雌性上海白豬31頭，體重22～28kg，術(shù)前行MR掃描測定基礎(chǔ)心功能數(shù)據(jù)。以改良法選擇性阻斷左冠狀動脈系統(tǒng)左室面分支60min后恢復(fù)血供，建立急性心肌梗死/再灌注模型?；謴?fù)血供15分鐘后將存活動物隨機(jī)分為4組:對照組(MI，

17、n=7)、eMSCs移植組(MI+cMSCs，n=7)、siMSCs移植組(MI+si-IGF-Ⅰ- MSCs，n=7)及oeMSCs移植組(MI+OE-IGF-Ⅰ-MSCs，n=7)。將包裹移植細(xì)胞的纖維蛋白基質(zhì)粘附于各細(xì)胞移植組梗死區(qū)心外膜表面，將纖維蛋白基質(zhì)包裹等量細(xì)胞培養(yǎng)液粘附于對照組病變處。分別于術(shù)后1周和4周行MRI檢查，評估左室整體收縮功能(LVEF)、梗死節(jié)段心肌局部收縮功能(STF)，測量心梗面積(SS)和心室容積，計(jì)

18、算室壁張力(SWS);比較各細(xì)胞移植組治療效果。術(shù)后第4周MR檢查后，對動物實(shí)施安死術(shù)，完成組織取材。通過組織學(xué)觀察、免疫熒光染色、免疫組化、Western blot等技術(shù)從干細(xì)胞遷移分化，新生血管形成以及增殖相關(guān)指標(biāo)IGF、Bcl-2和凋亡相關(guān)因子BAX表達(dá)情況等方面對IGF-Ⅰ修飾MSCs移植后的作用機(jī)制進(jìn)行研究。
　　結(jié)果:MR檢測發(fā)現(xiàn)，從術(shù)后1周起細(xì)胞移植組的LVEF和STF即較對照組有顯著改善(P＜0.05)，此種改善可

19、延續(xù)至術(shù)后4周，術(shù)后4周時(shí)oeMSCs組梗死面積和梗死邊緣區(qū)STF明顯優(yōu)于siMSCs組;術(shù)后4周時(shí)，細(xì)胞移植組反應(yīng)左室重構(gòu)程度指標(biāo)(LVW/BW)顯著優(yōu)于對照組(P＜0.05)，細(xì)胞移植組的收縮室壁張力(SWS)亦顯著低于對照組（P＜0.05）。手術(shù)4周后，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)病變心肌心外膜緣仍有纖維蛋白基質(zhì)附著;免疫熒光染色不僅證實(shí)細(xì)胞移植區(qū)仍有MSCs存活，還在梗死邊緣區(qū)發(fā)現(xiàn)已有少量MSCs分化為心肌樣細(xì)胞或與自體心肌發(fā)生細(xì)胞融合。oe

20、MSCs組在梗死及邊緣區(qū)血管密度均顯著高于其他各組(P＜0.05)。免疫組化及Western blot檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果得知，過表達(dá)組IGF蛋白表達(dá)量顯著高于其他各組(P＜0.05);Bcl-2和CD31蛋白表達(dá)量與IGF表達(dá)趨勢是一致的，而凋亡相關(guān)蛋白BAX表達(dá)趨勢與IGF恰相反。
　　結(jié)論:多孔纖維蛋白基質(zhì)是干細(xì)胞移植的優(yōu)良載體，MSCs移植可有效改善心肌梗死后的左室重構(gòu)，明顯提高心功能，IGF-Ⅰ過表達(dá)修飾的MSCs治療效果優(yōu)于單