蟲(chóng)源性IgE依賴(lài)組胺釋放因子對(duì)Ⅰ型超敏反應(yīng)性疾病的影響及其機(jī)制研究.pdf

1、研究目的: 利用基因工程技術(shù)表達(dá)宿主(大鼠)源性和寄生蟲(chóng)(日本血吸蟲(chóng)和華支睪吸蟲(chóng))源性IgE依賴(lài)HRF，驗(yàn)證3種重組蛋白(rRttRF、rCsttRF和rSjHRF)的免疫交叉反應(yīng)性，體外實(shí)驗(yàn)觀(guān)察3種重組蛋白刺激宿主致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的功能，以及抗蟲(chóng)源性IgE依賴(lài)HRF的特異性抗體對(duì)宿主源性IgE依賴(lài)HRF生物學(xué)功能的影響，為蠕蟲(chóng)感染影響超敏反應(yīng)性疾病發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 研究方法: 1、根據(jù)GenBa

2、nk中已知的大鼠IgE依賴(lài)HRF(RHRF)mRNA序列設(shè)計(jì)引物，以Wistar大鼠肝組織中提取的總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增RHRF‘全長(zhǎng)cDNA序列，并通過(guò)TA克隆、藍(lán)白斑篩選和序列測(cè)定鑒定PCR產(chǎn)物序列是否正確；采用PCR方法分別從華支睪吸蟲(chóng)成蟲(chóng)cDNA質(zhì)粒文庫(kù)及已構(gòu)建的pGEX-4T-1-SiTCTP重組質(zhì)粒中擴(kuò)增CsHRF cDNA和sjHRF cDNA。 2、運(yùn)用生物信息學(xué)方法對(duì)RHRF cDNA、CsHRF

3、 cDNA和sjHRF cDNA推導(dǎo)氨基酸序列的各級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和比較，包括氨基酸序列同源性比較、分子進(jìn)化分析、功能域預(yù)測(cè)、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析、抗原表位分析、空間構(gòu)象預(yù)測(cè)等，評(píng)價(jià)三者在各級(jí)結(jié)構(gòu)中的相似性。 3、將RHRF cDNA克隆至原核表達(dá)載體pET-28a(+)及pET-30a(+)：將CsHRF cDNA和SiHRF cDNA分別克隆至原核表達(dá)載體pET-30a(+)；通過(guò)PCR、雙酶切及序列測(cè)定對(duì)各重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。

4、 4、將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)，獲取原核表達(dá)的可溶性重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF，并利用親和層析方法進(jìn)行純化。 5、將純化的rCsHRF和rsjHRF分別免疫Wistar大鼠，制備免疫血清；利用Protein G樹(shù)脂通過(guò)親和層析方法分別純化2種免疫血清中的總IgG。 6、利用ELISA和Western Blotting分析重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rsjHRF的免疫交叉

5、反應(yīng)性。 7、以氫氧化鋁為佐劑，用雞卵清蛋白(OVA)致敏Wistar大鼠；采用I型膠原酶和透明質(zhì)酸酶消化法，對(duì)大鼠肺組織中的致敏肥大細(xì)胞進(jìn)行原代分離和培養(yǎng)。 8、運(yùn)用熒光分光光度法檢測(cè)3種重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF及致敏原OVA誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的劑量依賴(lài)關(guān)系，所用濃度梯度為101μg/ml，501μg/ml，100μg/ml，150μg/ml，200μg/ml。 9、運(yùn)用熒光分光光度

6、法檢測(cè)3種重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺與時(shí)間的關(guān)系，所觀(guān)察的反應(yīng)時(shí)間分別為5min、15 min、25min、35min、45min。 10、運(yùn)用熒光分光光度法檢測(cè)純化后的抗rCsHRF IgG和抗rSjHRF IgG對(duì)重組蛋白rRHRF誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的影響，每種抗體所用體積百分比濃度為1/5，2/5，3/5。 研究結(jié)果: 1、采用RT-PCR及TA克隆篩選，獲

7、得了RHRF全長(zhǎng)cDNA，采用PCR擴(kuò)增得到了CsHRF和sjHRF全長(zhǎng)cDNA。其中RHRF cDNA全長(zhǎng)516bp，推導(dǎo)氨基酸序列長(zhǎng)172aa；CsHRF cDNA和SjHRF cDNA長(zhǎng)度均為507 bp，推導(dǎo)氨基酸序列長(zhǎng)169aa。 2、生物信息學(xué)分析表明，RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA推導(dǎo)氨基酸序列的預(yù)測(cè)分子量分別為19596.4 Da，19331.0 Da，19375.7 Da，理論等電點(diǎn)依次為4.99，

8、5.06，4.73。多物種HRF氨基酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)了14個(gè)完全一致的氨基酸殘基：1(M)，11(D)，12(E)，55(E)，72(D)，79(L)，94(Y)，96(K)，144(G)，145(E)，170(P)，176(K)，182(E)，183(K)；分子進(jìn)化分析顯示RHRF氨基酸序列與小鼠HRF親緣關(guān)系最近，與人HRF具有相同起源，CsHRF與SjHRF親緣關(guān)系最近，且兩者與脊椎動(dòng)物HRF的親緣關(guān)系高于與無(wú)脊椎動(dòng)物(果蠅

9、、蝦、秀麗桿線(xiàn)蟲(chóng))及單細(xì)胞惡性瘧原蟲(chóng)的親緣關(guān)系，說(shuō)明日本血吸蟲(chóng)與華支睪吸蟲(chóng)的IgE依賴(lài)HRF可能與宿主的IgE依賴(lài)HRF存在協(xié)同進(jìn)化現(xiàn)象。RHRF與CsHRF氨基酸序列的一致性為43﹪，RHRF與sjHRF氨基酸序列的一致性為38﹪，CsHRF與SjHRF氨基酸序列的一致性為61﹪。三者均屬于TCTP家族(IPR001983)，含有基本相同的結(jié)構(gòu)域；三者所含二級(jí)結(jié)構(gòu)的類(lèi)型完全相同，且各種二級(jí)結(jié)構(gòu)在分子中所占比例極為相似；三者的空間構(gòu)象基

10、本一致，尤其是0L螺旋區(qū)均具有保守的線(xiàn)性表位。 3、成功構(gòu)建了RHRF、CsHRF和SjHRF cDNA的原核表達(dá)載體pET-28-rRHRF、pET-30-rRHRF、pET-30-rCsHRF及pET-30-rSjHRF，各重組蛋白均在轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21獲得表達(dá)，但可溶性表達(dá)水平不一，經(jīng)親和層析方法獲得了純化的可溶性重組蛋白rRHeF、rCsHRF和rSjHRF。 4、ELISA和Western Blotting證實(shí)重組蛋

11、白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF三者之間存在免疫交叉反應(yīng)性，且rRHRF/rCsHRF及rPHRF/rSjHRF之間的免疫交叉反應(yīng)性主要由構(gòu)象表位決定，線(xiàn)性表位介導(dǎo)的交叉反應(yīng)較弱。 5、重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺具有劑量依賴(lài)關(guān)系：當(dāng)重組蛋白濃度從10μg/ml上升至150μg/ml過(guò)程中，致敏肥大細(xì)胞組胺釋放率隨之上升；但當(dāng)重組蛋白濃度達(dá)到200μg/ml時(shí)，部分實(shí)驗(yàn)中致敏肥大

12、細(xì)胞組胺釋放率反而有所下降；rRHRF誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的能力高于rCsHRF和rSjHRV，但低于變應(yīng)原OVA。 6、重組蛋白rRHRF、rCsHRF和rSjHRF誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)顯示：3種重組蛋白誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞組胺釋放率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在反應(yīng)開(kāi)始后35min左右組胺釋放率達(dá)到最高；達(dá)到50﹪最大組胺釋放率時(shí)間約需15～20min。 7、不同濃度(1/5，2/5，3/5)的純化抗rCsH

13、RF IgG和抗rSjHRF IgG可以部分抑制重組蛋白rRHRF(75μg/ml)誘導(dǎo)致敏肥大細(xì)胞釋放組胺的功能，但抗體抑制作用的強(qiáng)弱與抗體滴度之間是否存在劑量依賴(lài)關(guān)系還需進(jìn)一步驗(yàn)證。 結(jié)論： 1、寄生蟲(chóng)IgE依賴(lài)HRF與宿主IgE依賴(lài)HRF的氨基酸序列一致性雖然不高，但具有非常相似的空間結(jié)構(gòu)，三種重組蛋白的免疫交叉反應(yīng)性證實(shí)了其結(jié)構(gòu)的相似性，這種交叉反應(yīng)主要由抗原的構(gòu)象表位決定。 2、rRHRF、rCsHRF

14、和rSjHRF誘導(dǎo)大鼠致敏肥大細(xì)胞釋放組胺具有劑量依賴(lài)關(guān)系，蟲(chóng)源性rCsHRF和rSjHRF可以模擬宿主內(nèi)源性rRHRF的生物學(xué)功能，抗蟲(chóng)源性IgE依賴(lài)HRF的抗體對(duì)宿主內(nèi)源性IgE依賴(lài)HRF的生物學(xué)效應(yīng)具有抑制作用，提示三者可能通過(guò)相同的功能域發(fā)揮效應(yīng)，具有共同的作用機(jī)制。 3、本研究初步證實(shí)了寄生性蠕蟲(chóng)感染可通過(guò)釋放蟲(chóng)源性IgE依賴(lài)HRF調(diào)節(jié)宿主I型超敏反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，為哮喘等I型超敏反應(yīng)性疾病的預(yù)防和治療