P-gp參與耐藥乳腺癌細胞侵襲與轉移的分子機制研究.pdf

1、目的：
　　越來越多的證據(jù)表明在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，耐藥和轉移的發(fā)生可能不是兩個孤立的過程，兩者之間存在一種功能上的聯(lián)系。前期實驗發(fā)現(xiàn)應用RNA干擾技術降低Anxa2的表達量后耐藥乳腺癌細胞的轉移能力明顯降低。說明Anxa2表達升高可能是耐藥乳腺癌細胞轉移能力增強的重要原因。眾所周知，腫瘤耐藥的發(fā)生80％是由P-glycoprotein(P-gp)介導的。我們實驗室前期實驗表明在乳腺癌耐藥細胞中，Anxa2的表達隨著MDR1的升

2、高而同步升高，免疫熒光檢測也證實兩種蛋白之間存在良好的共定位，我們推測P-glycoprotein和Anxa2的相互作用促進耐藥乳腺癌細胞的轉移。本研究應用免疫共沉淀、免疫熒光、Westrenblotting、ShRNA等多種實驗技術，研究P-glycoprotein的表達和活性改變對Anxa2的表達和酪氨酸磷酸化的影響，并深入探討這種協(xié)同作用促進耐藥腫瘤細胞轉移能力的分子機制。
　　方法：
　　1.采用RNA干擾技術使人多

3、藥耐藥乳腺癌MCF-7/ADR細胞中P-glycoprotein蛋白的表達水平下降，并用Westren blotting技術驗證其表達水平。
　　2.應用噻唑藍(MTT)比色法實驗檢測P-glycoprotein降表達對MCF-7/ADR細胞增殖能力的影響，以及細胞對阿霉素的敏感性。
　　3.流式細胞術用來檢測P-glycoprotein抑制劑是否對P-glycoprotein泵的活性有效。
　　4.應用體外遷移和侵襲

4、實驗檢測P-glycoprotein表達水平下降后對多藥耐藥乳腺癌細胞MCF-7/ADR體外遷移和侵襲能力的影響。
　　5.免疫共沉淀技術用來檢測P-glycoprotein和Anxa2的相互作用，同時采用免疫熒光技術來觀察二者在細胞內的共定位情況，再結合劃痕實驗進一步分析二者對細胞遷移的影響。
　　6.應用Westren blotting和免疫共沉淀技術來研究ERK1/2信號通路和Anxa2的酪氨酸磷酸化的變化，從而探討這

5、種協(xié)同作用促進耐藥腫瘤細胞的轉移能力增強的分子機制。
　　結果：
　　1.應用RNA干擾技術，按照轉染試劑的說明書轉染MCF-7/ADR細胞后，篩選到三株穩(wěn)定的P-glycoprotein降表達的單克隆細胞。
　　2.P-glycoprotein降低表達后MCF-7/ADR的增殖能力無明顯改變，但其耐藥能力都有明顯的下降。
　　3.體外侵襲實驗結果表明P-glycoprotein蛋白表達水平下降后MCF-7/AD

6、R的遷移和侵襲能力明顯被抑制。
　　4.免疫共沉淀技術發(fā)現(xiàn)P-glycoprotein和Anxa2在MCF-7/ADR細胞中存在相互作用，應用免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)二者在細胞膜上存在良好的共定位。劃痕實驗也表明二者共定位于劃痕邊緣的細胞膜上。
　　5.Westren blotting實驗結果顯示在MCF-7/ADR細胞中無論是降低P-glycoprotein的表達還是抑制其活性，都影響了阿霉素誘導的ERK1/2的磷酸化。
　

7、　6.免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)P-glycoprotein能調節(jié)Anxa2的酪氨酸磷酸化水平。
　　結論：
　　1.在多藥耐藥MCF-7/ADR細胞中，P-glycoprotein和Anxa2存在相互作用并且在細胞膜上存在良好的共定位。
　　2.P-glycoprotein表達水平降低和抑制其活性后，MCF-7/ADR細胞的遷移能力明顯下降，體外侵襲能力也明顯減弱。
　　3.進一步的機制研究結果顯示：在多藥耐藥乳腺癌細