MicroRNAs在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中的功能與機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、miR-548j作用于Tensin1并通過激活Cdc42促進(jìn)乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率一直呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。盡管目前針對(duì)乳腺癌的診療手段有了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，然而由乳腺癌轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的死亡仍然是乳腺癌患者的主要死因，也使得乳腺癌的死亡率一直位于女性腫瘤死亡率的前列，因此，深入了解乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制，尋找乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中潛在的分子標(biāo)志物，為乳腺癌的診斷和治療提供更多的靶點(diǎn)是目前亟需解決

2、的問題。
　　MicroRNA作為一類高度保守的非編碼單鏈小RNA，自發(fā)現(xiàn)起已被證實(shí)在多個(gè)物種中發(fā)揮重要作用，通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控參與并影響幾乎所有的生理和病理進(jìn)程。已有大量研究報(bào)道證實(shí)不少microRNA在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著促進(jìn)或者抑制的調(diào)節(jié)功能。由于microRNA的數(shù)目繁多，新的microRNA還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，這些新發(fā)現(xiàn)的microRNA在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中的調(diào)控機(jī)制目前尚不明確。因此，我們在本研究中將重點(diǎn)探索目前尚未被

3、發(fā)現(xiàn)的、在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)功能的microRNA以及它們的作用機(jī)制。
　　我們使用包含近1000個(gè)不同pri-miRNAs的microRNA Library慢病毒文庫感染侵襲轉(zhuǎn)移能力微弱的MCF-7細(xì)胞，然后通過Transwell的方法篩選出獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的細(xì)胞單克隆并進(jìn)行測序，得到數(shù)十個(gè)可能促進(jìn)MCF-7發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的microRNAs。經(jīng)過體外Transwell實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證后，我們選擇對(duì)MCF-7侵襲轉(zhuǎn)移促進(jìn)效果最明

4、顯的miR-548家族成員之一——miR-548j作為我們后續(xù)的研究對(duì)象。通過體外及體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)miR-548j能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，同時(shí)并不影響乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。然后，我們使用多個(gè)數(shù)據(jù)庫軟件進(jìn)行分析預(yù)測，認(rèn)為Tensin1可能為miR-548j的靶基因，并且通過體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Tensin1為miR-548j的直接及功能性靶基因。接下來，我們通過對(duì)Tensin1的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，尋找其可能參與的信號(hào)通路。在

5、對(duì)這些通路上的關(guān)鍵分子進(jìn)行逐一檢測后，我們確定miR-548j抑制Tensin1的表達(dá)并激活Cdc42，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，并且我們分別使用Cdc42 siRNA和活性抑制劑驗(yàn)證miR-548j抑制Tensin1并促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移需要激活Cdc42。隨后，我們對(duì)60例新鮮冰凍乳腺癌組織以及其配對(duì)的癌旁組織進(jìn)行了qRT-PCR和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)miR-548j在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于非轉(zhuǎn)移

6、性乳腺癌(p=0.022)，而Tensin1的表達(dá)則與miR-548j相反，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織中低表達(dá)(p=0.03)。然后我們對(duì)這兩者以及Cdc42的表達(dá)水平在組織標(biāo)本中的相關(guān)性進(jìn)行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-548j與Tensin1的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，與Cdc42的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)，而Tensin1則與Cdc42的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-548家族在乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用，并且證實(shí)其家族成員——mi

7、R-548j能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。隨后，我們對(duì)miR-548j在乳腺癌轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制進(jìn)行了深入研究，找到其功能性靶基因以及所影響的信號(hào)通路。同時(shí)，我們也對(duì)miR-548j與臨床乳腺癌轉(zhuǎn)移性之間的關(guān)系進(jìn)行了檢測分析，為深入了解乳腺癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制找到一個(gè)新的方向，并且為臨床乳腺癌的診療找到一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。
　　第二部分、SNAI1-miR-182負(fù)反饋環(huán)路調(diào)節(jié)EMT,從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的克隆形成和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移
　　腫瘤轉(zhuǎn)移

8、是一個(gè)多階段、多步驟的復(fù)雜過程:腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)灶組織進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，沿循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)靶器官，最終形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。在這個(gè)過程中，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)被認(rèn)為是整個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移的起始步驟，腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT脫離原發(fā)灶組織，獲得運(yùn)動(dòng)能力，然后通過EMT的可逆過程——間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(Mesenchymal-Epithelial Transition，MET)在靶器官定植并形成遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移

9、灶。
　　MicroRNA作為一大類通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的方式參與腫瘤轉(zhuǎn)移過程的分子，已經(jīng)被證實(shí)在EMT過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。許多研究報(bào)道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少microRNAs通過促進(jìn)或者抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，最終影響整個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移的過程。然而，作為在腫瘤轉(zhuǎn)移中和EMT同等重要的MET，有關(guān)microRNA對(duì)MET的調(diào)控目前卻鮮有報(bào)道。因此，我們在本研究中將重點(diǎn)研究microRNA在MET和腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過程中的功能和作用機(jī)制。
　　作

10、為EMT的可逆過程，發(fā)生MET的腫瘤細(xì)胞中基因和microRNA的表達(dá)正好與EMT相反，因此，我們通過一個(gè)EMT的模型來尋找可能在MET過程中發(fā)揮作用的基因和microRNA。首先，我們在MCF-10A中過表達(dá)EMT的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子——SNAI1，使MCF-10A發(fā)生EMT，然后通過microRNA芯片和cDNA芯片分別找出在這個(gè)過程中發(fā)生改變的microRNA和基因，并通過生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測它們之間可能存在的miRNA-mRNA調(diào)

11、節(jié)網(wǎng)絡(luò)。然后，我們選取了出現(xiàn)在調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中盼六個(gè)microRNAs(miR-498、miR-935、miR-200c、miR-203、miR-182和miR-378)進(jìn)行了qRT-PCR的驗(yàn)證，并最終確定將miR-182作為我們后續(xù)研究的目標(biāo)。我們首先通過ChIP和Luciferase reporter實(shí)驗(yàn)證實(shí)SNAI1對(duì)miR-182存在直接調(diào)控作用，然后我們通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-182使乳腺癌細(xì)胞保持上皮樣狀態(tài)，并且能夠部分逆轉(zhuǎn)SN

12、AI1所誘導(dǎo)的EMT過程。隨后，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠體內(nèi)，miR-182在肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)中的表達(dá)水平高于原位腫瘤，并且我們也通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-182能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在遠(yuǎn)端器官的克隆形成能力和轉(zhuǎn)移。接下來，我們通過數(shù)據(jù)庫分析預(yù)測出miR-182潛在的下游靶基因，并且在實(shí)驗(yàn)中非常意外地發(fā)現(xiàn)SNAI1為miR-182的下游靶基因，通過實(shí)驗(yàn)我們找到了在SNAI1的3'UTR區(qū)上miR-182的結(jié)合位點(diǎn)。此外，我們用動(dòng)物模型證實(shí)敲降SNAI1的乳腺

13、癌細(xì)胞在經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)后轉(zhuǎn)移至肺的能力明顯增強(qiáng)。接下來，我們對(duì)40例新鮮冰凍乳腺癌以及配對(duì)癌旁組織標(biāo)本進(jìn)行了miR-182和SNAI1表達(dá)水平的檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-182和SNAI1在乳腺癌組織中的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)?？紤]到miR-182主要是在乳腺癌細(xì)胞克隆形成和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，我們用ISH和IHC分別檢測了另外36例轉(zhuǎn)移性乳腺癌和配對(duì)轉(zhuǎn)移陽性的淋巴結(jié)組織中miR-182和SNAI1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)與原位腫瘤相比，miR-1

14、82在轉(zhuǎn)移陽性的淋巴結(jié)組織中表達(dá)增高，SNAI1的表達(dá)則與miR-182相反。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)SNAI1在抑制miR-182表達(dá)的同時(shí)能夠被miR-182負(fù)調(diào)節(jié)，這兩者之間的負(fù)反饋環(huán)路可能在EMT和MET相互轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，最終促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞在體內(nèi)靶器官的克隆形成和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。通過對(duì)臨床組織標(biāo)本的分析，我們發(fā)現(xiàn)SNAI1和miR-182的相互負(fù)調(diào)節(jié)作用在臨床組織標(biāo)本中同樣存在。然而有關(guān)SNAI1-miR-182之間