MicroRNAs在乳腺癌侵襲轉移過程中的功能與機制研究.pdf

1、第一部分、miR-548j作用于Tensin1并通過激活Cdc42促進乳腺癌的侵襲轉移
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，近年來，其發(fā)病率一直呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。盡管目前針對乳腺癌的診療手段有了實質性的進展，然而由乳腺癌轉移導致的死亡仍然是乳腺癌患者的主要死因，也使得乳腺癌的死亡率一直位于女性腫瘤死亡率的前列，因此，深入了解乳腺癌的轉移機制，尋找乳腺癌轉移過程中潛在的分子標志物，為乳腺癌的診斷和治療提供更多的靶點是目前亟需解決

2、的問題。
　　MicroRNA作為一類高度保守的非編碼單鏈小RNA，自發(fā)現(xiàn)起已被證實在多個物種中發(fā)揮重要作用，通過轉錄后調控參與并影響幾乎所有的生理和病理進程。已有大量研究報道證實不少microRNA在乳腺癌侵襲轉移的過程中發(fā)揮著促進或者抑制的調節(jié)功能。由于microRNA的數(shù)目繁多，新的microRNA還在不斷地被發(fā)現(xiàn)，這些新發(fā)現(xiàn)的microRNA在乳腺癌轉移過程中的調控機制目前尚不明確。因此，我們在本研究中將重點探索目前尚未被

3、發(fā)現(xiàn)的、在乳腺癌轉移過程中發(fā)揮重要調節(jié)功能的microRNA以及它們的作用機制。
　　我們使用包含近1000個不同pri-miRNAs的microRNA Library慢病毒文庫感染侵襲轉移能力微弱的MCF-7細胞，然后通過Transwell的方法篩選出獲得侵襲轉移能力的細胞單克隆并進行測序，得到數(shù)十個可能促進MCF-7發(fā)生侵襲轉移的microRNAs。經(jīng)過體外Transwell實驗驗證后，我們選擇對MCF-7侵襲轉移促進效果最明

4、顯的miR-548家族成員之一——miR-548j作為我們后續(xù)的研究對象。通過體外及體內功能實驗，我們證實miR-548j能夠促進乳腺癌細胞的侵襲轉移，同時并不影響乳腺癌細胞的增殖能力。然后，我們使用多個數(shù)據(jù)庫軟件進行分析預測，認為Tensin1可能為miR-548j的靶基因，并且通過體外及體內實驗證實Tensin1為miR-548j的直接及功能性靶基因。接下來，我們通過對Tensin1的結構和功能進行分析，尋找其可能參與的信號通路。在

5、對這些通路上的關鍵分子進行逐一檢測后，我們確定miR-548j抑制Tensin1的表達并激活Cdc42，從而促進乳腺癌細胞的侵襲轉移，并且我們分別使用Cdc42 siRNA和活性抑制劑驗證miR-548j抑制Tensin1并促進乳腺癌細胞的侵襲轉移需要激活Cdc42。隨后，我們對60例新鮮冰凍乳腺癌組織以及其配對的癌旁組織進行了qRT-PCR和Western blot檢測，發(fā)現(xiàn)miR-548j在轉移性乳腺癌組織中的表達水平明顯高于非轉移

6、性乳腺癌(p=0.022)，而Tensin1的表達則與miR-548j相反，在轉移性乳腺癌組織中低表達(p=0.03)。然后我們對這兩者以及Cdc42的表達水平在組織標本中的相關性進行了檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-548j與Tensin1的表達呈現(xiàn)負相關，與Cdc42的表達呈現(xiàn)正相關，而Tensin1則與Cdc42的表達呈現(xiàn)負相關。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-548家族在乳腺癌細胞的侵襲轉移中發(fā)揮了重要的作用，并且證實其家族成員——mi

7、R-548j能夠促進乳腺癌細胞的侵襲轉移。隨后，我們對miR-548j在乳腺癌轉移中的作用機制進行了深入研究，找到其功能性靶基因以及所影響的信號通路。同時，我們也對miR-548j與臨床乳腺癌轉移性之間的關系進行了檢測分析，為深入了解乳腺癌的轉移機制找到一個新的方向，并且為臨床乳腺癌的診療找到一個新的潛在靶點。
　　第二部分、SNAI1-miR-182負反饋環(huán)路調節(jié)EMT,從而促進乳腺癌細胞的克隆形成和遠端轉移
　　腫瘤轉移

8、是一個多階段、多步驟的復雜過程:腫瘤細胞脫離原發(fā)灶組織進入循環(huán)系統(tǒng)，沿循環(huán)系統(tǒng)到達靶器官，最終形成遠端轉移。在這個過程中，上皮-間質轉化(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)被認為是整個腫瘤轉移的起始步驟，腫瘤細胞發(fā)生EMT脫離原發(fā)灶組織，獲得運動能力，然后通過EMT的可逆過程——間質-上皮轉化(Mesenchymal-Epithelial Transition，MET)在靶器官定植并形成遠端轉移

9、灶。
　　MicroRNA作為一大類通過轉錄后調控的方式參與腫瘤轉移過程的分子，已經(jīng)被證實在EMT過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用。許多研究報道已經(jīng)發(fā)現(xiàn)不少microRNAs通過促進或者抑制腫瘤細胞發(fā)生EMT，最終影響整個腫瘤轉移的過程。然而，作為在腫瘤轉移中和EMT同等重要的MET，有關microRNA對MET的調控目前卻鮮有報道。因此，我們在本研究中將重點研究microRNA在MET和腫瘤遠端轉移過程中的功能和作用機制。
　　作

10、為EMT的可逆過程，發(fā)生MET的腫瘤細胞中基因和microRNA的表達正好與EMT相反，因此，我們通過一個EMT的模型來尋找可能在MET過程中發(fā)揮作用的基因和microRNA。首先，我們在MCF-10A中過表達EMT的關鍵轉錄因子——SNAI1，使MCF-10A發(fā)生EMT，然后通過microRNA芯片和cDNA芯片分別找出在這個過程中發(fā)生改變的microRNA和基因，并通過生物信息學的方法分析預測它們之間可能存在的miRNA-mRNA調

11、節(jié)網(wǎng)絡。然后，我們選取了出現(xiàn)在調節(jié)網(wǎng)絡中盼六個microRNAs(miR-498、miR-935、miR-200c、miR-203、miR-182和miR-378)進行了qRT-PCR的驗證，并最終確定將miR-182作為我們后續(xù)研究的目標。我們首先通過ChIP和Luciferase reporter實驗證實SNAI1對miR-182存在直接調控作用，然后我們通過體外實驗證實miR-182使乳腺癌細胞保持上皮樣狀態(tài)，并且能夠部分逆轉SN

12、AI1所誘導的EMT過程。隨后，我們發(fā)現(xiàn)在小鼠體內，miR-182在肺轉移結節(jié)中的表達水平高于原位腫瘤，并且我們也通過動物實驗證實miR-182能夠促進乳腺癌細胞在遠端器官的克隆形成能力和轉移。接下來，我們通過數(shù)據(jù)庫分析預測出miR-182潛在的下游靶基因，并且在實驗中非常意外地發(fā)現(xiàn)SNAI1為miR-182的下游靶基因，通過實驗我們找到了在SNAI1的3'UTR區(qū)上miR-182的結合位點。此外，我們用動物模型證實敲降SNAI1的乳腺

13、癌細胞在經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內后轉移至肺的能力明顯增強。接下來，我們對40例新鮮冰凍乳腺癌以及配對癌旁組織標本進行了miR-182和SNAI1表達水平的檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-182和SNAI1在乳腺癌組織中的表達呈現(xiàn)負相關。考慮到miR-182主要是在乳腺癌細胞克隆形成和遠端轉移過程中發(fā)揮作用，我們用ISH和IHC分別檢測了另外36例轉移性乳腺癌和配對轉移陽性的淋巴結組織中miR-182和SNAI1的表達，發(fā)現(xiàn)與原位腫瘤相比，miR-1

14、82在轉移陽性的淋巴結組織中表達增高，SNAI1的表達則與miR-182相反。
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)SNAI1在抑制miR-182表達的同時能夠被miR-182負調節(jié)，這兩者之間的負反饋環(huán)路可能在EMT和MET相互轉換過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用，最終促進乳腺癌細胞在體內靶器官的克隆形成和遠端轉移。通過對臨床組織標本的分析，我們發(fā)現(xiàn)SNAI1和miR-182的相互負調節(jié)作用在臨床組織標本中同樣存在。然而有關SNAI1-miR-182之間